初代ラットの分離と性状バルブ間質細胞: 大動脈弁石灰化を研究するための新しいモデル

すべての動物実験は、ロスリン研究所の動物ユーザー委員会によって承認された、動物のケアとの動物の使用のためのホーム オフィス (イギリス) ガイドラインに従って維持されました。下記プロトコル、5 週間の古い、男性スプレイグ ラットが使用されました。 1. 試薬のレシピ ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と栄養混合物 F-12 (DMEM/f12 キー) を使用して培養液の準備します。10% 滅菌熱不活化牛胎児血清 (FBS) と 1% のゲンタマイシンを追加します。 培養液と 2.7 mM Ca/2.5 Pi を使用して石灰化媒体の準備します。 CaCl2 555 mg を量り分けると 1 M CaCl2の 5 mL を作るため 5 mL の蒸留水に溶解して1 M 塩化カルシウム(CaCl2) を準備します。ソリューションをソリューションを殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターをフィルターします。 計量 710 mg 無水塩基リン酸ナトリウム (Na2HPO4) うちと無水塩基性リン酸ナトリウム (NaH2PO4) 600 mg を 5 mL の蒸留水に溶解して1 M リン酸ナトリウムを準備します。水。ソリューションを殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターを通して 3,870 μ L の Na2HPO4 1,130 μ NaH2PO4とフィルターを組み合わせます。 準備、洗浄バッファーをハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) と 1% のゲンタマイシンを含有します。 2. 解離フードの準備 以前サンプルおよび試薬の無菌性を確保するための 70% エタノールで消毒、換気フードのすべての解剖を実施します。 郭清ツールをそれらを使用する前に 70% エタノールを含むビーカーにツールのヒントを浸すことによって続いたオートクレーブで滅菌します。 ビーカー洗浄バッファーを含むを準備し、動物や組織と接触する前に洗浄バッファーで郭清ツールを浸します。すべての回で氷の上洗浄バッファーを保持します。 3. 初代ラット VICs の抽出 注: 以下に示すプロトコルの 5 週間の古い、男性スプレイグ ラットが使用されました。 ラットを処分 (~ 100 g) 英国ホーム オフィスのガイドラインに従って子宮頸の転位で。 各ラットの心臓を解剖するには、ガラス解剖板に動物の仰臥位を配置し、70% エタノールを噴霧して皮膚を消毒します。 ラットの腹腔内を公開し、胸郭と肺、心臓を公開する慎重に取り外します、解剖はさみの助けを借りて正中線で 4 cm の切開を行います。 シャープのペアで心臓を取り出して曲線はさみを春ラットの総解剖のすべてが完了するまで氷冷洗浄バッファーで切り裂かれた心を保管します。 マイクロ – それぞれの心の解剖、ペトリ皿に転送、後者は洗浄バッファーで説明します。小さな周辺では、上行大動脈、大動脈と左に春まっすぐハサミ (6 mm 刃) と心筋をトリムします。 同じを使用してまっすぐはさみ (6 mm 刃) の春、慎重に左心室に向かって上行大動脈を切開、大動脈弁のリーフレットを公開します。 新鮮な滅菌シャーレ HBSS でいっぱいに開いた大動脈を転送します。Vannas 型 capsulotomy マイクロ剪刀 (刃 3 mm) のペアで、大動脈の基部、ユニークな ‘U’ の形状によって特徴づけられる、大動脈弁のリーフレットを解剖します。 すべてのチラシを 1 mL の氷冷洗浄バッファーすべて解剖が完了するまでは、1.5 mL 遠心チューブに格納します。 すべてのチラシが収穫された後は、洗浄バッファーを削除する 4 ° C で 1 分 100 × g で遠心します。 滅菌を確実に細胞文化フードで後続の手順を実行します。100 μ L 425 U/mL コラゲナーゼ II 37 ° C で 5 分間のリーフレットを消化、VECs を削除するには200 μ L ピペット チップを使って軽くピペッティングして消化を中断します。 100 × g で遠心する 30 s、リーフレットをペレットし、上澄みを慎重に廃棄します。500 μ L の洗浄バッファーで 2 回洗浄し、30 の 100 × g で遠心分離によって細胞を再ペレット s。 チラシから VICs を収穫するには、2 h 425 U/mL コラゲナーゼ II の 100 μ L で消化し、上下に 200 μ L ピペット チップを使用して軽くピペッティングして VICs を解放します。 19 ml 培養液とビックスと残りの弁尖の残骸をペレットに 5 分間、670 × g で遠心するコラゲナーゼ II を希釈します。培養上清を破棄し、それに応じて文化板/フラスコにリーフレットや VICs を転送 (表 1)。 培養 72 時間後のメディアの変更培地、37 ° c、5% (二酸化炭素) CO2の存在下での confluency に到達するまでに 5-7 日間 VICs。In vitroの実験でその後の使用のための通路 5 回まで合流したら 100% に達する。 4. ラット VICs の石灰化の誘導 注: すべての実験のため、診断とセルをカウントします。 シードと汚染を防ぐために滅菌のフードの継のすべての一次電池を実行します。石灰化実験の in vitroの初代ラット VICs を準備をするには、細胞/ウェル 6 ウェル プレートで 150,000 の密度で細胞を播きます。≥ 90% の confluency (通常 72 h) まで培地の維持します。 石灰化を制御媒体対 VICs を扱い、37 ° c、5% CO2、さらに 72 時間の存在下で孵化させなさい。 以降の下流解析の石灰化の初代ラット VICs を勉強するには、石灰化/制御媒体を削除および非バインドの Ca と Pi のイオンを除去するのに洗浄バッファーで単分子膜を洗浄します。 5. ラット ヴィックのキャラクタリゼーション ビメンチンと α-SMA のシード細胞/ウェル 6 ウェル プレートで 150,000 の密度でラット VICs などの表現型マーカーを監視する免疫染色を含むカバー スリップ (セルはカバー スリップの表面に増加します)、50% の confluency まで成長しておきます。 培養培地を吸引し、5 分毎回 10 分のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 回を洗濯する前に 4% パラホルムアルデヒド (PFA) と細胞膜を修正します。注意: PFA は毒性があり慎重に処理する必要があります。 ブロックと透過バッファーでセル単一層を孵化させなさい (1 × PBS、二次抗体と同じ種から正常な血清の 5%、0.3% トリトン X-100) 室温で 1 時間。 細胞膜を抗体希釈バッファーで希釈し、マウス抗ビメンチンとウサギ抗 α SMA の抗体とインキュベート (1% ウシ血清アルブミン + 0.3 %pbs でトリトン X-100) 一晩 4 ° c、そっとロッカーに揺れ。注: 否定的なコントロールから成って非共役マウス IgG とウサギ IgG、テスト サンプルとして同じ希釈液を使用します。 次の日 3 回 5 分たびに PBS の一次抗体を洗浄します。 ロッカーに優しく揺れ、常温で 1 h の蛍光標識二次抗体と細胞膜を孵化させなさい。 PBS 洗浄 3 回、鉗子、coverslip 含む 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 上の場所のペアを持つ coverslips (ラット VICs を含んだ) を軽くピンセットで抜きます。蛍光顕微鏡による可視化の前に 4 ° C で、少なくとも 24 時間を治すためスライドを残します。 西部のしみの分析の 150,000 の密度で VICs 6 ウェル プレートで細胞/ウェルと合流まで 100% 成長培地のままのラットをシードします。 CD31 の発現を測定し、VEC 汚染を排除するのに西部のしみを実行するのに蛋白質の 8 μ g を使用します。注: 標準的な西部のしみのプロトコルは、9を前述のように続いた。 遺伝子研究、製造元のガイドラインに従って商業キットを使用してリボ核酸 (RNA) を抽出します。 ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用してターゲット遺伝子発現を測定する逆のトランスクリプションを使用して cDNA を取得およびリアルタイム PCR (RT-PCR 法; 別名 qPCR) 緑蛍光検出、以前として参照の遺伝子としてGapdhの使用10を説明します。 PCR 解析の次のプログラムを使用: 94 ° C の 3 分の 1 サイクル 30 サイクル 94 ° C の 30 s、63 ° C、30 s、72 ° C、35 s、および 5 分の 72 ° C の最後に 1 サイクル。 QPCR 分析のために次のプログラムを使用: 95 ° c、10 分間 1 サイクル 95 の 40 のサイクルの 30 s、95 ° C、30 ° C 15 秒、1 分、1 分、55 ° C の 95 ° C の追加サイクルの 60 ° C の s。 トリス、ホウ酸塩、EDTA (TBE) バッファーに 2% の agarose のゲルを使用して PCR の製品を分析するゲルの電気泳動を実行します。 6. ラット ヴィック石灰化研究 アリザリン赤 S および生化学的な石灰化研究は、セクション 4 で説明されているシードと石灰化のガイドラインに従ってください。 5% アリザリンレッド S 溶液、20 分間、シェーカーで優しくロッキングと細胞膜を染色します。その後 5 分間たびに、蒸留水で 3 回を洗ってください。各ウェルの画像を取得します。 Ca 沈着を定量化するには、生化学的 Ca 測定キットを使用します。穏やかな動揺と、4 ° C で 24 時間 0.6 M 塩酸 (HCl) を使用して Ca2 +イオンを溶出します。 収穫 Ca アッセイを用いた Ca 濃度キット (材料表参照) 清とメジャー メーカーのガイドラインに従います。 総細胞蛋白質の一部分としてカルシウム濃度を計算します。0.1 M 水酸化ナトリウム (NaOH) + 0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) と細胞膜から細胞蛋白質を変化します。製造元のガイドラインに従って、互換性のある洗剤 (DC) 蛋白質のアッセイを用いた総蛋白濃度を決定します。