בידוד ואפיון של החולדה הראשית שסתום תאים ביניים: מודל חדש ללמוד הסתיידות שסתום אבי העורקים

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי הוועדה משתמשים בעלי חיים של רוזאלין המכון, ומתוחזק החיות היו על פי הנחיות משרד הפנים (בריטניה) הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים. עבור פרוטוקול המתואר להלן, שימשו חולדות ספראג Dawley 5 – בן שבועיים, זכר. 1. מגיב מתכונים הכינו את תרבות בינוני באמצעות מדיום נשר שונה (DMEM) של Dulbecco מזין תערובת F-12 (DMEM/F12). להוסיף 10% לעקר להשבית חום העובר שור סרום (FBS) ו גנטמיצין 1%. הכן של הסתיידות בינוני באמצעות תרבות בינוני ו- 2.7 מ”מ Ca/2.5 מ”מ Pi. הכן 1 מ’ סידן כלורי (2CaCl) על ידי שוקל 555 מ”ג CaCl2 את זה במים מזוקקים מ ל לעשות 5 מ של 1 מ’ CaCl2. לסנן את הפתרון דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 לחטא את הפתרון. להכין 1 מ’ סודיום פוספט על ידי שקילה החוצה 710 מ ג נטול מים dibasic סודיום פוספט (נה2HPO4), 600 מ”ג של נטול מים monobasic סודיום פוספט (NaH2PO4), המסת כל אחד בנפרד בכתב מ ל מזוקקים . מים. לשלב 3,870 µL של נה2HPO4 µL 1,130 NaH2PO4, מסנן דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 לחטא פתרון. הכינו את לשטוף את מאגר המכיל גנטמיצין מאוזנת פתרון מלח (HBSS) ו- 1% של האנק. 2. הכנת למכסה לנתיחה לבצע ניתוח כל בשכונה מאוורר, חיטוי בעבר עם 70% אתנול כדי להבטיח עקרות של ריאגנטים ודוגמאות. לחטא כלי ניתוח מאת autoclaving שאותם ואחריו הטבעית את תיאורי הכלים בתוך המכיל 70% אתנול לפני השימוש. להכין בקבוקונים המכילים שטיפת מאגר, ומשרים בכלי ניתוח במאגר לשטוף לפני בא במגע עם בעל חיים או רקמות. לשמור על המאגר שטיפת על קרח בכל עת. 3. מיצוי של עכברוש ראשי הקורבנות הערה: עבור פרוטוקול המתואר להלן, חולדות ספראג Dawley 5 – בן שבועיים, זכר שימשו. ללקט את החולדות (~ 100 גרם) על ידי נקע בצוואר הרחם לפי הנחיות משרד הפנים בבריטניה. שווייץ בלב כל עכברוש, במקום החיה פרקדן על קרש חיתוך זכוכית, לחטא את העור ע י ריסוס עם 70% אתנול. עושים חתך 4 ס מ בהאמצע של העכברוש בעזרת מספריים לנתיחה, כדי לחשוף את חלל הבטן, הסר בזהירות את הצלעות והריאות, לחשוף את הלב. להסיר את הלב עם זוג של שארפ, מעיין מספריים מעוגלים, ולאחסן בלב ביתור במאגר כביסה קרה קרח עד והניתוחים דוחה כל העכברושים הושלמו. לנתח מיקרו-כל לב, ההעברה האחרון לתוך צלחת פטרי מכוסה במאגר לשטוף. חתוך את שריר הלב עם זוג מספריים ישר האביב (6 מ מ להבים) להישאר עם אזור קטן המקיפים של אבי העורקים, את בסיס אב העורקים. באמצעות אותו מעיין מספריים ישר (6 מ מ להבים), בזהירות לחתוך של אבי העורקים לכיוון החדר השמאלי ולחשוף העלעלים שסתום אבי העורקים. העברת העורקים שנפתח לתוך צלחת פטרי טריים, סטרילי מלא HBSS. שווייץ העלעלים שסתום אבי העורקים, מסומן על ידי הצורה ‘U’ הייחודית שלהם בבסיס של אבי העורקים, עם Vannas-סוג capsulotomy מיקרו-מספריים (להב 3 מ מ). אחסן כל העלעלים 1 מ”ל מאגר כביסה קרה קרח, צינור microcentrifuge 1.5 mL עד והניתוחים כל הושלמו. לאחר כל העלעלים נקצצו, centrifuge אותם ב- g x 100 עבור 1 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את המאגר לשטוף. בצע את השלבים הבאים בשכונה התרבות התא כדי להבטיח עיקור. כדי להסיר את VECs, לעכל את כרוזים 100 µL 425 U/mL collagenase II עבור 5 דקות ב 37 º C. לשבש את תהליך העיכול על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה באמצעות טיפ פיפטה 200 µL. צנטריפוגה ב 100 x g ל 30 s כדי הצניפה העלעלים, ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה. לשטוף פעמיים עם מאגר לשטוף µL 500 ו הצניפה מחדש את התאים על ידי צנטריפוגה-g 100 x עבור 30 s. הקציר הקורבנות של העלעלים, לעכל עם 100 µL של collagenase U/mL 425 השני כבר שעתיים ולאחר מכן שחרר הקורבנות על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה באמצעות טיפ פיפטה 200 µL. לדלל את collagenase השני ב 19 מ”ל של תרבות בינונית, צנטריפוגה-g x 670 עבור 5 דקות כדי הצניפה את הקורבנות ופסולת הנותרים שסתום העלעל. למחוק את תגובת שיקוע, ולהעביר פליירים הקורבנות כדי תרבות צלחות/צלוחיות בהתאם (טבלה 1). תרבות הקורבנות במשך 5-7 ימים תרבות בינוני, עד confluency ב 37 מעלות צלזיוס, בנוכחות 5% (פחמן דו-חמצני) CO2, שינוי המדיום לאחר 72 h. לשימוש לאחר מכן ניסויים במבחנה , המעבר עד 5 פעמים ברגע confluency מגיע ל 100%. 4. אינדוקציה של הסתיידות של חולדה ממין הערה: עבור כל הניסויים, לספור תאים עם hemocytometer. לבצע כל התא הראשי seeding, passaging בברדסים סטיריליים למניעת זיהום. כדי להתכונן עכברוש ראשי הקורבנות במבחנה הסתיידות ניסויים, זרע את התאים על צפיפות של 150,000 תאים/טוב ב- 6-ובכן צלחות. לשמור על תרבות בינוני עד 90% ≥ confluency (בדרך כלל 72 h). לטיפול הקורבנות עם הסתיידות לעומת שליטה בינונית, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, בנוכחות 5% CO2, עבור h 72 נוספים. ללמוד החולדה הראשית מסויד הקורבנות עבור ניתוחים במורד הזרם עוקבות, להסיר את המדיום הסתיידות/בקרה ולשטוף את monolayers עם מאגר לשטוף כדי להסיר יונים שאינו מאוגד Ca ו- Pi. 5. עכברוש ויק אפיון עבור immunostaining לפקח על סמנים פנוטיפי כגון vimentin וα-SMA, זרע העכברוש הקורבנות-צפיפות של 150,000 תאים/טוב בובכן 6-פלטות המכילות שער גולשת (תאים יגדל על פני פתקי כיסוי), ולהשאיר לגדול עד 50% confluency. האחות המדיום תרבות ולתקן את monolayers תא עם 4% paraformaldehyde (PFA) 10 דקות לפני נטילת אותם 3 פעמים בתמיסת פוספט buffered (PBS), למשך 5 דקות בכל פעם.התראה: PFA הוא רעיל, יש לטפל בזהירות. דגירה של טפט תא עם מאגר חסימה ו permeabilization (PBS 1 x, 5% של סרום נורמלי מן מאותו המין כמו הנוגדן המשני, 0.3% טריטון X-100) לשעה בטמפרטורת החדר. דגירה של monolayers תא עם העכבר anti-vimentin וארנבת נוגדנים anti-α-SMA מדולל במאגר דילול נוגדנים (אלבומין פרה 1% + 0.3% טריטון X-100 ב- PBS) בן לילה 4 ° C, בעדינות רועד על כיסא נדנדה.הערה: פקדי שלילי כללה עכבר שאינו מצומדת IgG וארנבת IgG, באמצעות של דילולים אותו כמו הבדיקה דוגמאות. ביום הבא, לשטוף את הנוגדנים ראשי 3 פעמים עם PBS, למשך 5 דקות בכל פעם. דגירה של תאים monolayers עם fluorophore מצומדת נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר, מנענע בעדינות על כיסא נדנדה. לשטוף 3 פעמים עם PBS, בעדינות tweeze החוצה coverslips (אשר מכילים חולדה ממין) עם זוג מלקחיים ומקום על coverslip המכיל 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי). להשאיר את השקופיות כדי לרפא לפחות 24 שעות ב 4 ° C לפני להמחיש עם מיקרוסקופ זריחה. לניתוח תספיג, זרע העכברוש הקורבנות-צפיפות של 150,000 תאים/באר היטב 6-פלטות ולהשאיר לצמוח התרבות בינוני עד 100% confluent. השתמש µg 8 של חלבון כדי להפעיל תספיג למדוד את הביטוי של CD31, לשלול כל זיהום VEC.הערה: פרוטוקול סטנדרטי תספיג יושם כפי שתואר לעיל9. ללימודים ג’ין, לחלץ חומצה ריבונוקלאית (RNA) באמצעות ערכת מסחרי בעקבות הנחיות היצרן. להשיג cDNA באמצעות שעתוק במהופך כדי למדוד את הביטוי של גנים היעד באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), בזמן אמת PCR (RT-PCR; ידוע גם בשם qPCR) עם זיהוי fluorophore ירוק, באמצעות Gapdh כמו הגן הפניה, כמו בעבר תיאר10. השתמש התוכנית הבאה לניתוח ה-PCR: 1 מחזור 94 ° C למשך 3 דקות, מחזורים של 94 ° C ל 30 s, 63 ° C ל 30 s, 72 ° C עבור 35 s, ו 1 סוף סוף מחזור 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. השתמש התוכנית הבאה לניתוח qPCR: 1 מחזור 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורי 95 ° C 15 s, 60 ° C 1 דקות, מחזור נוסף של 95 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, 55 ° C s 30, ו 95 ° C ל 30 s. הפעל בג’ל לנתח PCR מוצרים באמצעות ג’ל agarose 2% במאגר טריס/בוראט/EDTA (TBE). 6. עכברוש ויק הסתיידות מחקרים עבור Alizarin אדום S ומחקרים ביוכימיים הסתיידות, אנא עקוב אחר ההנחיות seeding, הסתיידות המתוארות בסעיף 4. כתם על monolayers תא עם פתרון 5% S Alizarin אדום, נדנדה בעדינות על מטרף, כעשרים דקות. לאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם מים מזוקקים, למשך 5 דקות בכל פעם. לרכוש תמונות של כל טוב. כדי לכמת את התצהיר Ca, להשתמש ערכת assay Ca הביוכימי. ליץ Ca2 + יונים באמצעות 0.6 מטר חומצת מימן כלורי (HCl) במשך 24 שעות ביממה ב 4 ° C, עם עצבנות עדין. לקצור את תגובת שיקוע ולמדוד הריכוז Ca שימוש assay Ca של קיט (ראה טבלה של חומרים) בעקבות הנחיות היצרן. חשב את ריכוז הסידן כשבר של חלבון תאית הכולל. Denature הסלולר מהחלבונים monolayers התא עם 0.1 M הידרוקסיד הנתרן (NaOH) + 0.1% נתרן dodecyl סולפט (מרחביות). לקבוע ריכוז החלבון הכולל שימוש של דטרגנט תואם (DC) חלבון assay בעקבות הנחיות היצרן.