Isolement et caractérisation des primaires de Rat vanne cellules interstitielles : un nouveau modèle pour étudier la Calcification de la Valve aortique

Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité des usagers de l’Institut Roslin de l’Animal, et les animaux ont été maintenues conformément aux directives du ministère de l’intérieur (Royaume-Uni) pour le soin et l’utilisation des animaux. Pour le protocole décrit ci-dessous, 5 – semaine vieux, hommes rats Sprague Dawley ont été utilisés. 1. recettes de réactif Préparer le milieu de culture à l’aide de Dulbecco Eagle modifié (DMEM) et mélange nutritif F-12 (DMEM/F12). Ajouter 10 % stérilisés inactivés par la chaleur foetale de sérum bovin (FBS) et 1 % de gentamicine. Préparer le milieu de la calcification à l’aide de milieu de culture et 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi. Préparer le chlorure de calcium 1 M (CaCl2) pesant sur 555 mg de CaCl2 et en dissolvant dans 5 mL d’eau distillée pour faire 5 mL 1 M CaCl2. Filtrer la solution avec une seringue-filtre de 0,22 µm pour stériliser la solution. Préparer le phosphate de sodium 1 M par pesage 710 mg phosphate de sodium dibasique anhydre (Na2HPO4) et 600 mg de phosphate de sodium monobasique anhydre (NaH2PO4), dissoudre chacun séparément dans 5 mL eau distillée eau. Mélanger 3 870 µL de Na2HPO4 et 1 130 µL de NaH2PO4et le filtre par un filtre de seringue 0,22 µm pour stériliser la solution. Préparer le tampon de lavage contenant de Hank Balanced Salt Solution (HBSS) et 1 % de gentamicine. 2. préparation de la hotte de Dissection Effectuer toutes les dissections sous une hotte ventilée, préalablement désinfecté à l’éthanol à 70 % pour assurer la stérilité d’échantillons et de réactifs. Stériliser les outils de dissection à l’autoclave que leur suivis en immergeant les pointes des outils dans un bécher contenant avant l’éthanol 70 % utilisation. Préparer les béchers contenant du tampon de lavage et tremper les outils de dissection dans le tampon de lavage avant d’entrer en contact avec l’animal ou les tissus. Garder le tampon de lavage sur la glace à tout moment. 3. extraction de primaires de Rat VICs Remarque : Le protocole décrit ci-dessous, 5 – semaine vieux, hommes rats Sprague Dawley ont été utilisés. Abattre les rats (~ 100 g) par dislocation cervicale conformément aux lignes directrices UK Home Office. Pour disséquer le cœur de chaque rat, placez l’animal en position couchée sur une planche de dissection de verre et désinfecter la peau en pulvérisant avec l’éthanol à 70 %. Faire une incision de 4 cm dans la ligne médiane du rat à l’aide de ciseaux de dissection, pour exposer la cavité abdominale et retirez soigneusement la cage thoracique et les poumons, pour exposer le cœur. Enlever le coeur avec une paire de sharp, ciseaux courbes de printemps et stocker le cœur disséqué dans le tampon de lavage à froid de glace jusqu’à ce que toutes les dissections brutes des rats sont terminées. Pour micro-disséquer chaque cœur, transférer ces dernier dans une boîte de Pétri couverts dans le tampon de lavage. Coupez le muscle cardiaque avec une paire de ciseaux droites de printemps (lame de 6 mm) pour se retrouver avec une petite zone autour de l’aorte ascendante et la racine aortique. En utilisant le même printemps ciseaux droite (lame de 6 mm), soigneusement découpé l’aorte vers le ventricule gauche et exposer les feuillets de la valve aortique. Transférer l’aorte ouverte dans une boite de Petri fraîches, stérile, rempli de HBSS. Disséquer les tracts de valve aortique, marqués par leur unique forme de « U » à la base de l’aorte, avec une paire de Vannas-type capsulotomie micro-ciseaux (lame de 3 mm). Rangez tous les dépliants dans 1 mL de tampon de lavage froid de glace, dans un tube de microtubes de 1,5 mL jusqu’à ce que toutes les dissections sont terminées. Une fois que tous les dépliants ont été récoltés, les centrifuger à 100 x g pendant 1 min à 4 ° C à retirer le tampon de lavage. Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture cellulaire afin d’assurer la stérilisation. Pour supprimer les CVÉ, digérer les folioles dans 100 collagénase de U/mL 425 II µL pendant 5 min à 37 ° C. Perturber la digestion en pipettant également doucement et descendre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL. Centrifuger à 100 x g pendant 30 s à folioles de granule et éliminer le liquide surnageant avec soin. Laver deux fois avec 500 µL de tampon de lavage et re-pellet les cellules par centrifugation à 100 x g pendant 30 s. Pour récolter les VICs de folioles, digérer avec 100 µL de 425 collagénase de U/mL II pendant 2 h et puis relâchez les VICs de pipetage doucement et descendre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL. Diluer la collagénase II dans 19 mL de milieu de culture et centrifuger à 670 x g pendant 5 min granuler la CIV et les débris restants de leaflet vanne. Jeter le surnageant et transférer des folioles et Cie à plaques/flacons de culture en conséquence (tableau 1). Culture les VICs pendant 5 à 7 jours dans le milieu de culture, jusqu’à confluence à 37 ° C, en présence de 5 % (dioxyde de carbone) CO2, changer le support après 72 h. Pour une utilisation ultérieure dans des expériences in vitro , passage jusqu’à 5 fois une fois confluency atteint 100 %. 4. induction d’une Calcification du Rat VICs Remarque : Pour toutes les expériences, compter les cellules avec un hémocytomètre. Effectuer toutes les cellules primaires l’amorçage et le passage dans des hottes stérilisés pour éviter la contamination. Pour préparer VICs primaires de rat in vitro les expériences de la calcification, les semences des cellules à une densité de 150 000 cellules/puits dans les plaques 6 puits. Maintenir dans un milieu de culture jusqu’à la confluence ≥ 90 % (généralement de 72 h). Traiter la CIV avec calcification versus milieu témoin et incuber à 37 ° C, en présence de 5 % CO2, pendant 72 h supplémentaires. Pour étudier le rat primaire calcifié VICs pour les analyses suivantes en aval, enlever le fluide/calcification et laver les monocouches avec tampon de lavage pour enlever les ions Ca et Pi non liées. 5. rat VIC caractérisation Pour immunostaining à surveiller pour les marqueurs phénotypiques, comme par exemple la vimentine et α-SMA, le rat VICs à une densité de 150 000 cellules/puits dans 6-plats de graines contenant des lamelles (cellules seront développe sur la surface des feuillets de la couverture) et laisser grandir jusqu’à la confluence de 50 %. Aspirer le milieu de culture et fixer les monocouches de cellules avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min avant de les laver 3 fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), pendant 5 minutes chaque fois.ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin. Incuber la monocouche de cellules avec un tampon bloquant et perméabilisation (PBS de 1 x, 5 % de sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaire, 0,3 % Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante. Incuber les monocouches de cellules avec les anticorps d’anti-α-SMA anti-vimentine et lapin de souris dilués dans du tampon de dilution des anticorps (albumine de sérum 1 % + 0,3 % Triton X-100 dans du PBS) durant la nuit à 4 ° C, secouant doucement sur une bascule.NOTE : Contrôles négatifs se comprenaient de souris non Conjugué IgG et lapin IgG, en utilisant les mêmes dilutions que les échantillons de test. Le lendemain, laver les anticorps primaires 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes chaque fois. Incuber les monocouches de cellules avec des anticorps secondaires conjugué à un fluorophore pendant 1 h à température ambiante en agitant doucement sur une bascule. Laver 3 fois avec du PBS et tweeze doucement sur les lamelles couvre-objet (qui contiennent rat VICs) avec une paire de pinces et déposer sur un lamelle couvre-objet contenant 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Laissez les diapositives pour soigner pendant au moins 24 h à 4 ° C avant de visualiser avec un microscope à fluorescence. Pour l’analyse par Western blot, amorcer le rat VICs à une densité de 150 000 cellules/puitsent dans 6-plaques à puits et laissent à grandir dans un milieu de culture jusqu’à 100 % confluentes. 8 µg de protéines permet d’exécuter un Western blot permettant de mesurer l’expression de CD31 et exclure toute contamination de VEC.Remarque : Un protocole standard de Western blot a été suivi comme décrit plus haut9. Pour les études de génétique, extraire l’acide ribonucléique (ARN) à l’aide d’une trousse commerciale suivant les directives du fabricant. Obtenir le cDNA utilisant transcriptase inverse pour mesurer l’expression des gènes cibles en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la PCR en temps réel (RT-PCR ; également connu sous le nom qPCR) avec détection de fluorophore vert, à l’aide de Gapdh comme le gène de référence, comme précédemment décrit les10. Utiliser le programme suivant pour analyse PCR : 1 cycle de 94 ° C pendant 3 min, 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 63 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 35 s et enfin 1 cycle de 72 ° C pendant 5 min. Utiliser le programme suivant pour l’analyse de qPCR : 1 cycle de 95 ° C pendant 10 min, 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 1 min et d’un cycle supplémentaire de 95 ° C pendant 1 min, 55 ° C pour 30 s et 95 ° C pendant 30 s. Exécutez une électrophorèse pour analyser les produits PCR à l’aide d’un gel d’agarose de 2 % dans un tampon Tris/Borate/EDTA (TBE). 6. rat VIC Calcification études Rouge d’alizarine S et études biochimiques de la calcification, veuillez suivre l’ensemencement et la calcification des directives visées à l’article 4. Tacher les monocouches de cellules avec une solution de 5 % solution d’alizarine S, poussant doucement sur un agitateur, pendant 20 min. Par la suite laver 3 fois avec de l’eau distillée, pendant 5 minutes chaque fois. Acquisition d’images de chaque puits. Afin de quantifier les dépôts de Ca, utiliser un kit de dosage biochimique Ca. Leach ions Ca2 + à l’aide de 0,6 M d’acide chlorhydrique (HCl) pendant 24 h à 4 ° C, avec agitation douce. Récolter le surnageant et mesure la concentration de Ca à un dosage de Ca kit (voir Table des matières) suivant les directives du fabricant. Calculer la concentration de calcium sous forme de fraction du total des protéines cellulaires. Dénaturer les protéines cellulaires des monocouches de cellules avec 0,1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) + 0,1 % dodécylsulfate de sodium (SDS). Déterminer la concentration de protéine totale à un dosage protéique compatible détergent de (DC) suivant les directives du fabricant.