Isolatie en karakterisatie van primaire Rat klep interstitiële cellen: een nieuw Model voor het bestuderen van verkalking van de aortaklep

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Roslin Instituut het dier gebruikerscomité, en de dieren werden gehandhaafd overeenkomstig thuiskantoor (UK) richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van dieren. Voor de hieronder beschreven protocol werden 5 – week oud, mannelijke Sprague-Dawley ratten gebruikt. 1. reagens recepten Bereid het kweekmedium gebruik van Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) en voedende mengsel F-12 (DMEM/F12). Voeg 10% gesteriliseerd warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en 1% gentamicine. De verkalking medium gebruik kweekmedium en 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi voor te bereiden. Bereiden 1 M calciumchloride (CaCl2) door weging uit 555 mg CaCl2 en ontbinding van het in 5 mL gedestilleerd water om 5 mL CaCl, 1 M2. Filtreer de oplossing door een 0,22 µm spuit filter om de oplossing te steriliseren. Bereiden van 1 M natriumfosfaat door weging 710 mg watervrij dibasische natriumfosfaat (nb2HPO4) en 600 mg van watervrij monobasisch natriumfosfaat (NaH2PO4), ontbinding van elk afzonderlijk in 5 mL gedistilleerd water. 3870 µL van nb2HPO4 en 1.130 µL van NaH2PO4, en filter combineren door een 0,22 µm spuit filter te steriliseren oplossing. Bereiden de buffer wassen met Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) en 1% gentamicine. 2. voorbereiding van de dissectie-kap Alle dissecties in een geventileerde kap, eerder ontsmet met 70% ethanol om de steriliteit van monsters en reagentia uitvoeren. Dissectie tools steriliseren in autoclaaf die hen gevolgd door de toppen van de hulpprogramma’s in een bekerglas van 70% ethanol vóór gebruik onder te dompelen. Bekerglazen met was buffer voor te bereiden, en geniet van de dissectie-hulpmiddelen in was buffer voor komst in contact met het dier of de weefsels. Houd de buffer wassen op ijs te allen tijde. 3. extractie van primaire Rat VICs Opmerking: Voor de hieronder beschreven protocol 5 – week oud, mannelijke Sprague-Dawley ratten werden gebruikt. Ruiming van de ratten (~ 100 g) door cervicale dislocatie overeenkomstig de richtsnoeren van de UK Home Office. Plaats het dier liggende op een glas dissectie bord om te ontleden uit het hart van elke rat, en ontsmetting van de huid door te sproeien met 70% ethanol. Maak een incisie van 4 cm in de middellijn van de rat met behulp van de dissectie schaar, bloot de buikholte, en verwijder voorzichtig de ribbenkast en de longen, het hart bloot te stellen. Verwijderen van het hart met een paar voor sharp, spring gebogen schaar en de ontleed hart in ijs koud was buffer opslaan totdat alle bruto ontledingen van de ratten voltooid zijn. Om de micro-ontleden elk hart, bedekt overdracht de laatste in een petrischaal met was buffer. Trim de hartspier met een lente rechte schaar (6 mm mes) worden verlaten met een klein gebied rondom de oplopende aorta en de aorta wortel. Met behulp van hetzelfde voorjaar rechte schaar (6 mm mes), zorgvuldig opengesneden de oplopende aorta naar het linkerventrikel en bloot de aortaklep folders. Breng het geopende aorta in een frisse, steriele petrischaal gevuld met HBSS. Ontleden uit de aortaklep folders, gekenmerkt door hun unieke vorm van de ‘U’ aan de voet van de aorta, met een Vannas-type capsulotomy micro-schaar (3 mm mes). Alle folders worden opgeslagen in 1 mL ijs koud was buffer, in een 1,5 mL microcentrifuge buis totdat alle dissecties voltooid zijn. Zodra alle folders zijn geoogst, centrifugeer ze bij 100 x g voor 1 min bij 4 ° C tot het verwijderen van de was-buffer. Opeenvolgende stappen in een cel cultuur kap om sterilisatie uitvoeren. Als u wilt verwijderen van de VECs, verteren de folders in 100 µL 425 U/mL collagenase II gedurende 5 minuten bij 37 ° C. De spijsvertering verstoren door zachtjes op en neer met behulp van een pipet tip van 200 µL pipetteren. Centrifugeer bij 100 x g gedurende 30 s tot pellet de folders, en verwijder het supernatant zorgvuldig. Wassen tweemaal met 500 µL was buffer- and -pellet opnieuw de cellen door centrifugeren bij 100 x g gedurende 30 s. Om te oogsten de VICs van de brochures, verteren met 100 µL van 425 U/mL collagenase II voor 2 h en laat u vervolgens de VICs door zachtjes op en neer met behulp van een pipet tip van 200 µL pipetteren. Verdun de collagenase II in 19 mL gestolde voedingsbodem en centrifuge bij 670 x g gedurende 5 min naar de pellet de VICs en resterende ventiel leaflet puin. Vloeistof wordt weggeworpen en folders en VICs overbrengen naar cultuur platen/kolven dienovereenkomstig (tabel 1). Cultuur de VICs voor 5-7 dagen in een cultuurmedium, totdat confluentie bij 37 ° C, in aanwezigheid van 5% (koolstofdioxide) CO2, wijzigen van het medium na 72 uur wordt bereikt. Voor latere gebruik in in vitro experimenten, passage tot 5 keer zodra confluency 100% bedraagt. 4. de inductie van verkalking van de Rat VICs Opmerking: Voor alle experimenten, cellen met een hemocytometer tellen. Het uitvoeren van alle primaire cel zaaien en passaging in gesteriliseerde afzuigkappen om verontreiniging te voorkomen. Beënt primaire rat VICs om voor te bereiden in vitro verkalking experimenten, de cellen bij een dichtheid van 150.000 cellen per putje in 6-Wells-platen. Tot ≥ 90% confluentie (meestal 72 h) in een kweekvloeistof handhaven. Behandel de VICs met calcificatie versus controle medium en Incubeer bij 37 ° C, in aanwezigheid van 5% CO2, voor een extra 72 h. Studeren de primaire kalkhoudend rat VICs voor latere downstream analyses, verwijder het medium verkalking/controle en wassen de monolayers met was buffer voor het verwijderen van niet-gebonden Ca en Pi ionen. 5. rat VIC karakterisering Voor immunokleuring te controleren voor fenotypische markeringen zoals vimentin en α-SMA, zaad de rat VICs bij een dichtheid van 150.000 cellen per putje in 6 goed-platen die bevatten cover slips (cellen zal groeien op het oppervlak van de cover glijdt), en laat hem groeien tot 50% confluentie. Het kweekmedium gecombineerd en monteren van de cel monolayers met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten vóór het wassen ze 3 keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gedurende 5 minuten elke keer.Let op: PFA is giftig en moet voorzichtig worden omgegaan. Incubeer de cel enkelgelaagde met blokkeren en permeabilization buffer (1 x PBS, 5% van de normale serum van dezelfde soort als het secundaire antilichaam, 0.3% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Incubeer de cel monolayers met muis anti-vimentin en konijn anti-α-SMA antilichamen verdund in antilichaam verdunning buffer (1% bovien serumalbumine + 0,3% Triton X-100 in PBS) ‘s nachts bij 4 ° C, zachtjes schudden op een rocker.Opmerking: Negatieve controles bestond uit muis niet-geconjugeerde IgG en konijn IgG, met behulp van de dezelfde verdunningen als de analysemonsters. Op de volgende dag, afwassen de primaire antilichamen 3 keer met PBS, gedurende 5 minuten elke keer. Incubeer de cel monolayers met fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, zachtjes schudden op een rocker. 3 keer wassen met PBS en zachtjes tweeze uit de coverslips (die bevatten rat VICs) met een paar pincet en plaats op een dekglaasje aan met 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Laat de dia’s te genezen voor ten minste 24 uur bij 4 ° C vóór visualiseren met een fluorescentie Microscoop. Beënt de rat VICs bij een dichtheid van 150.000 cellen per putje in 6 goed-platen en laten groeien in een kweekvloeistof tot 100% confluente voor westelijke vlekkenanalyse. Gebruik 8 µg eiwit wilt uitvoeren van een westelijke vlek te meten van de uitdrukking van CD31 en elke VEC-besmetting uitsluiten.Opmerking: Een standaard westelijke vlek-protocol werd gevolgd zoals eerder beschreven9. Pak voor gene studies, RNA acid (RNA) met behulp van een commerciële kit volgens de richtlijnen van de fabrikant. Verkrijgen van cDNA met behulp van omgekeerde transcriptie voor het meten van de doelgenen expressie met behulp van de polymerase-kettingreactie (PCR) en PCR in real time (RT-PCR; ook bekend als qPCR) met groene fluorophore de detectie, met behulp van Gapdh als het referentie-gen, zoals voorheen 10beschreven. Gebruik het volgende programma voor PCR analyse: 1 cyclus van 94 ° C gedurende 3 minuten, 30 cycli van 94 ° C voor 30 s, 63 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 35 s, en tot slot 1 cyclus van 72 ° C gedurende 5 minuten. Het volgende programma gebruikt voor qPCR analyse: 1 cyclus van 95 ° C gedurende 10 minuten, 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 1 minuut en een extra cyclus van 95 ° C voor 1 min, 55 ° C voor 30 s, en 95 ° C gedurende 30 s. Voer een de Elektroforese van het gel voor het analyseren van PCR producten met behulp van een 2% agarose gel in Tris/boraat/EDTA (FSME) buffer. 6. rat VIC verkalking Studies Volg voor Alizarine Red S en verkalking van de biochemische studies, zaaien en verkalking richtsnoeren beschreven in sectie 4. Vlek de cel monolayers met 5% Alizarine rode S-oplossing, voorzichtig rocken op een shaker, voor 20 min. Vervolgens wassen 3 keer met gedestilleerd water, gedurende 5 minuten elke keer. Beelden van elk putje te verwerven. Om te kwantificeren Ca depositie, een biochemische Ca assay kit gebruiken. Leach Ca2 + ionen met 0,6 M zoutzuur (HCl) gedurende 24 uur bij 4 ° C, met zachte agitatie. Oogst de bovendrijvende vloeistof en meet de concentratie van de Ca met behulp van een Ca-assay kit (Zie Tabel van materialen) volgens de richtlijnen van de fabrikant. Bereken de concentratie van de calcium als een fractie van de totale cellulaire eiwit. Het denatureren van cellulaire eiwitten uit de cel monolayers met 0,1 M natriumhydroxide (NaOH) + 0,1% natrium dodecyl sulfaat (SDS). Bepaal de concentratie van de totale proteïne met behulp van een wasmiddel compatibel (DC) eiwit bepaling volgens de richtlijnen van de fabrikant.