Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Tüm hayvan deneyleri, yerel etik onaya tabi tutuldu ve Birleşik Krallık hükümeti Ev Ofisi lisansı koşulları altında gerçekleştirildi. 1. Deri Hasat ve Kriyoprezervasyon Hazırlıklar. 25 mL% 4 PFA içeren 100 mm'lik bir kültür çanağı ve 25 mL'lik 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki adet 100 mm'lik kültür çanağı hazırlayın. En uygun kesme sıcaklığı bileşiğiyle (OCT) üçte ikisi kadar dikdörtgen soyulmuş kristal kutuları doldurun. Kriyokokarların sonraki adımına yerleştirilebileceği bir metal plakayı -80 ° C derin dondurucuya yerleştirin. Cilt hasadı, fiksasyon ve kriyoprezervasyon. Hayvan kadavranın dorsal bölgesini kuru bir elektrikli tıraş makinesiyle kırpın. NOT: Bu örnekte, doğum sonrası gün 21 vahşi fareler kullanılmıştır. Cilt üzerinde ilgi alanları toplayın. NOT: Fare derisinin dorsomedial bölgesi ( <stronŞekil 1a) eşit olarak aralıklı ve hizalanan, kesitleme için en iyi yönlendirmeyi sağlayan kıl foliküllerinin en yüksek yüzdesini içerir. Altta yatan dermal olmayan dokunun çıkarılması gerekli değildir, ancak gerekirse yapılabilir. Hasat gören cildi, saç kökü tanesinin yönsel büyümesini hesaba katarak, kriyormoldun tabanına uyacak şekilde uygun boyutta dikdörtgen parçalara bölün. NOT: Küçük deri dilimleri, yeni başlayanlar için kuluçka ve montaj işlemi sırasında birbirine çarpma ihtimalleri daha düşük olduğu için işlenmesi daha kolay olabilir. Burada gösterilen örnek, bir 22 x 30 x 20 mm cryomold (Şekil 2a) içine uyan dorsal deri, bir yaklaşık 1 cm2 alandır. Deri numunelerinin kalınlığına bağlı olarak ( Şekil 1b ) 10-30 dakika, 25 mL% 4 PFA içinde oda sıcaklığında cildi düzeltin. Cilt örneklerini 25 mL PBS içinde iki kez yıkayınEn az 5 dakika boyunca ( Şekil 1b ). Dondurma işlemi sırasında kristalleşmeye neden olan ve cryosectioning sonuçlarını etkileyebilecek aşırı PBS dokusunu dikkatlice boşaltmak için cilt örneklerini kağıt havlu üzerine koyun. NOT: Standart bir sukroz gradyan gerekli değildir. Bununla birlikte, bu ayrıca kullanıcının takdirine bağlı olarak protokole dahil edilebilir. Her cilt örneği için saç köklerinin yöneliminin farkında olun. Görsel yardım için diseksiyon mikroskopu kullanın (özellikle ilk kez protokolü uygulayan herkes). Cilt örneğini OCT dolu dondurma ağzına yerleştirin ve forseps kullanarak kırpılmış saç yüzeyine yapışmış hava kabarcıkları çıkartarak cildin tüm alanlarını OCT ile dengeye getirin ( Şekil 2a ve 2b ). Cildi, OCT dolgulu bloğun altına iterek alt kısımyla aynı hizada olacak şekilde itin. NOT: Cilt herhangi bir yönde,Saç folikülü tanecikleri uygun kesim prosedürleri için belirtildiği sürece. Bloklar, kriyoterapi için kriyosataya tutturuldukça, cryomolds yeniden yönlendirilir. Bu adım, kriyostat kesiminin sonraki yönlendirmesini belirlediği için saç kökü yönlendirmesini cryomold üzerinde işaretleyin. Dondurucu blokları, dokunun yüzüp çıkmasını önlemek için -80 ° C derin dondurucunun metal plakasına aktarın. Görülmeyen hava kabarcığı cildin dondurucu yüzeyine yükselmesine neden olabileceğinden, cryomold'un altında cildin yönünü korumak için dondurma işlemini izleyin. NOT: Dondurulmuş dokuya sahip olan krison kapsülleri -80 ° C'de bir yıldan fazla saklanabilir ve ek bölümler için tekrar kullanılabilir. Şekil 1. Fare derisinin hasat edilmesi ve fiksasyonu. </strong> ( A ) Deri dokusu, hayvan kadaverinin dorsomedial bölgesinden hasat edildi. Bu bölgedeki kıl folikülleri eşit aralıklarla hizalanır ve bu nedenle oklarla gösterildiği gibi bölümleme esnasında optimum yönlendirme sağlar. ( B ) Kriyomole uyan uygun bir boyuttaki kareleri kestikten sonra, cilt dokusu 15 dakika% 4 PFA içinde sabitlenmiş ve her biri 5 dakika PBS'de iki kez yıkanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. 2. Kalın Doku Kesitleri Kriyostat üzerine monte edilecek hazırlık ve doku yönlendirmesi. 15 mL PBS ile 100 mm'lik bir kültür çanağı hazırlayın. Kriyostatın üzerinde kolayca erişilebilen bir alana koyun. Buna ek olarak, oyuk başına 2.5 mL PBS ile 12 oyuklu bir plaka hazırlayın; S uzun süreli saklama için örneklere göre etiket4 ° C sıcaklıkta. Bölümleri tutmak için forseps kullanın. Kriyostatın sıcaklığını -20 ° C'ye ayarlayın. NOT: Sıcaklık kesitlemeyi etkileyebilir, ancak iyi bir kılavuz -20 ° C'de başlamaktır. Yaklaşık iki folikül kalınlığına sahip bölümler elde etmek için kriyostatın kesitlerini 150 μm kalınlığa ayarlayın. NOT: Kesitin kalınlığı, kullanıcının ihtiyaçlarına ve analiz için kullanılacak mikroskop sınırlamalarına bağlı olarak değişebilir. NOT: Örneğin yönü, saç follikülleri ile uygun yönde cilt bölümleri elde etmek için kritiktir. Bu, kriyostat bloğuna düzgün şekilde monte edilerek gerçekleştirilir. Kesit düzleminin saç follikülü yönüne paralel olduğundan emin olun ( Şekil 2c ). Daha önce de belirtildiği gibi, cilt örneğinde kesit düzleminin doğru yönlendirilmesi, elde edilen görüntülerin kalitesini belirlemek için çok önemli bir adımdır.Daha sonraki bir adım. Şekil 2. Gömme, kriyoprezervasyon ve kesit alma. ( A ) Siyah oklarla belirtilen cryomold'da saç kökü (HF) yönünün işaretlenmesi, kriyoteksiyon sırasında doğru yönlendirme için önemlidir. ( B ) Kesit düzlemi, saç foliküllerinin tam uzunluğunun bozulmadığı bölümler oluşturmak için kıl folikül yönelimi ile hizalanmalıdır. ( C ) Kesitler, saç kökü yönünde siyah oklarla gösterilen kıl folikülü yönüne göre kesilmiştir. cryomold. ( D ) Kalın doku kesitleri metal forsepslerle toplandı ve ( e ) 1x PBS içeren 100 mm'lik bir kültür çanağına aktarıldı. ( F ) Oda sıcaklığında, PBS OC'yi uzaklaştırır.T. Beyaz oklarla gösterildiği gibi kalın doku kesitlerini çevreleyen bileşik. Bölümler daha sonra PBS'de serbestçe yüzerler. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Cryosectioning. Kriyostatı kullanarak bir kesit kesin. Gömülü deriyi içeren OCT'yi toplamak için forseps kullanın ( Şekil 2d ). NOT: Optimum numune konumlandırması için X, Y ve Z eksenlerinde bağımsız hareket ve ayarlama olanağı sağlayan bir kriyostat kullanın. Bu, ideal hizalı doku kesitlerinin oluşturulmasını sağlar. Kriyostatın bölümünü PBS ile dolu 100 mm'lik kültür çanağına aktarın ve bir sonraki dilimle devam edin. Örnekleri bir slaytta toplamayın ( Şekil 2e ). NOT: Oda sıcaklığında, PBS çözülürForseps ile ele alınması kolay deri dilimleri bırakarak ( Şekil 2f ) OCT. NOT: 100 mm kalınlığındaki birçok doku kesitini çözdükten sonra 100 mm'lik kültür çanağında taze PBS gerekli olabilir ve buna göre değiştirilebilir. Yüzen cilt bölümlerini 2.5 mL'lik PBS ile dolu 12 çukurlu bir kâğıda doğru şekilde etiketlenmiş kuyuya aktarmak için forseps kullanın ( Şekil 3a , solda). NOT: 4 ° C'de, numuneler en az iki gün boyunca depolanabilir. Kesitten sonra deri içeren OCT bloklarının uzun süre depolanması için, kesme yüzeyini yeni OCT damlacıklarıyla sızdırmaz kılın OCT damlasının dondurulmasından sonra kullanılan OCT bloğunu parafilm içine sarın ve tekrar -80 ° C dondurucuya yerleştirin . 3. İmmünofloresan etiketleme. PB tamponunu (% 0.5 yağsız süt tozu,% 0.25 balık cilt jelatin ve% 0.5 Triton X-100 ile takviye edilmiş PBS) leas'ta hazırlayınT 2 saat önce, daha önce tarif edildiği gibi 5 . NOT: Boyama tamponunun tekrar tekrar kullanılması için antikor koruması için PB tamponuna sodyum azid eklenebilir. 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine etiketleyin ve tüp başına 500 PB'lik PB tampon ekleyin. Deri dilimlerini PBS'den bloke etmek için PB tamponu içeren ayrı tüplere aktarmak için dikkatle forseps kullanın ( Şekil 3a , sağ). Tüm deri dilimlerinin tamamen suya daldığından emin olun. Mikro santrifüj tüplerini oda sıcaklığında 1 saat süreyle doku bütünlüğünü bozmamak için dakikada 10 osilasyondan daha yüksek olmayan bir hızda bir testere kulakçığı üzerine yerleştirin. NOT: Hızın, testere kulakçığı üzerinde dakika başına 10 salınımı aşmaması kritiktir, çünkü sıkışma meydana getirecektir. Her ne kadar mikrosantrifüj tüpü başına birden fazla dilim eklemek, antikorları kurtarmak mümkün olsa da, tüp başına sadece bir dilim yerleştirin. Antikor kullanımını azaltmak için, bir hacim kullanın250 uL. NOT: Gerekirse, örneğin 96 oyuklu plakalar ile mikro santrifüj tüplerini değiştirin. Bununla birlikte, kalın doku kesitlerinin 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine yerleştirilmesi, sıvı pertürbasyonunun artması nedeniyle dokuda en etkili antikor penetrasyonuna olanak tanır. Her bir cilt dilimi için ayrı 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve 500 uL PB tampon ve uygun birincil antikor miktarı ekleyin. 1 saatlik bloke olduktan sonra cilt dilimlerini, antikorları içeren taze hazırlanmış tüplere aktarın. Dilimleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. NOT: Bu örnekte, aşağıdaki primer antikorlar kullanılmıştır: 1: 50'lik bir konsantrasyonda FITC sıçan anti-insan CD49f'si ve 1: 100'lük bir konsantrasyonda keçi anti-fare / sıçan integrin alfa 8. Ertesi gün, örnek başına 500 μL PBS içeren iki ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. Cilt dilimleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca iki kez yıkanır.e. Uygulanabilir sekonder antikorların ve 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolün (DAPI) uygun konsantrasyonu ile 500 uL PB tampon içeren ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. NOT: Bu örnekte kullanılan sekonder antikorlar Alexa Fluor 488 eşek anti-sıçan IgG ve Alexa Fluor 555 eşek anti-keçi IgG'dir ve 1: 500'lük bir konsantrasyonda bulunur. DAPI, 1: 100 konsantrasyonda kullanıldı. Cilt örneklerini, ikincil antikor ve DAPI içeren PB tamponuna dikkatlice aktarın ve cilt dilimleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca düşük bir hızda rotator veya çalkalayıcıda inkübe edin. Dilimleri 4 ° C'de ikincil antikor ve DAPI içeren PB tamponuna dört güne kadar saklayın ve sodyum azid PBS'ye ilave edilirse muhtemelen daha uzun süre saklayın. Şekil 3. İmmunofluoreskopEtiketleme ve montaj. ( A ) Yüzen doku kesitleri 12 yuvalı plakalarda en az iki gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir. İmmünoflöresan (IF) etiketlemeden önce, ilgilenilen doku kesitlerini, okla gösterildiği gibi bloke etmek için PB tamponu içeren 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. IF etiketi için, 3. adımda ayrıntılı olarak hazırlanan çok adımlı işleme dikkat edin. Basamak 3'ün bir kısmı, ok 2 ile gösterilen birincil antikor çözeltisi, ikincil antikor çözeltisi veya yıkama tamponu içeren yeni hazırlanmış mikrosantrifüj tüplerine doku kesitlerinin dikkatle aktarılmasını gerektirir. ( B ) IF etiketi sonrasında, doku çapraz kesitleri, Kesit mikroskop yardımı ile gliserol damlasında çözülür ve düzleştirilir. ( C ) Doku kesiti, bir kapak kaymasının tabanına tamamen düzleştirildiğinde, bölümün monte edilmesi için düzenli bir mikroskop lamı kullanılır. <aHref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg" target = "_ blank"> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız. 4. Mikroskopik Görselleştirme için Montaj Görüntülemeden önce, cilt dilimlerini, ikincil antikorları ve DAPI'yı uzaklaştırmak için 500 μL PBS içeren ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. 1000 μL'lik bir pipet kullanın, ancak son derece yapışkan gliserolün uygun pipetlenmesini sağlamak için pipet ucunun ilk 0,5 cm'ini kesin. Bir diseksiyon mikroskop ( Şekil 3b ) altında koyu bir arka plan üzerine bir 22 x 50 mm lamel yerleştirin. Kaplama kağıdına bir damla% 100 gliserol ekleyin ( Şekil 3b ). Cilt dilimini mikrosantrifüj tüpünden gliserol damla üzerine aktarın. Düzeltici mikroskopu kullanın ve kıvrılmış olan cilt dilimlerini özenle çözmek için forsepsleri işaretleyin. NOT: Dilim glifte yüzerkenSerum damlacıklarında dokunun doğal görünümünü normal şekline geri döndürerek dengelenebilir. Dilimin doğal olmayan düzleştirmesini zorlamayın çünkü bu dokuya zarar verebilir. Deri bölümünün tüm uzunluğu kapak kayma düzeneğine uygun şekilde yönlendirilip düzleştirildiğinde dokuyu monte edin; Düzenli bir mikroskop slayt kullanın. Bu adım cilt dilimini daha da düzleştirir. NOT: Hava sızıntısından kaçının ( Şekil 3c ). Önümüzdeki iki gün içinde gliserole monte cilt bölgelerindeki görüntüsünü alın. NOT: Uzun süreli saklama doku ve görüntüleme kalitesini olumsuz etkileyecektir. Bu örnekte, tüm görüntüler 20x'lik bir objektif kullanılarak dik bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi.