水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

すべての動物実験は、地元の倫理的承認の対象となり、英国政府のホームオフィスライセンスの条件で実施されました。 1.スキンハーベストと凍結保存 準備。 1％リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）25 mLを含む25 mLの4％PFAと2つの100 mm培養皿で100 mm培養皿1枚を調製します。 最適切断温度化合物（OCT）を用いて長方形のピールアウェイクライオールドを3分の2で満たす。 クライオブロックを後のステップに置くことができる金属板を-80°Cの冷凍庫に置きます。 皮膚収穫、固定および凍結保存。 乾燥した電気シェーバーで動物の死体の背部をクリップする。 注：この例では、生後21日の野生型マウスを使用した。 皮膚の関心領域を収穫します。 注：マウス皮膚の背側領域（ <stron図1a）は、均等に間隔をあけて位置合わせされた毛包の割合が最も高く、これにより、セクション分けのための最適な方向付けが可能になる。下にある非皮膚組織の除去は必要ではないが、必要に応じて行うことができる。 収穫した皮膚をクライオモールドの底に収まるように適切な大きさの長方形の部分に切り取って、毛包穀物の方向性の成長を考慮してください。 注：小さなスキンスライスは、インキュベーションやマウントプロセス中につまずく可能性が少ないため、初心者にとっては扱いやすいかもしれません。ここに示されている例は、背部皮膚の約1cm 2の領域であり、22×30×20mmのクライオブラッドに収まる（ 図2a ）。 皮膚サンプルの厚さに応じて、室温で4％PFA 25 mLで10-30分間固定します（ 図1b ）。 25mLのPBSで皮膚サンプルを2回洗浄するそれぞれ少なくとも5分間（ 図1b ）。 凍結過程で結晶化を起こし、凍結切片の結果に影響を与える可能性のある余分なPBSの組織を慎重に排水するために、ペーパータオル上で皮膚サンプルを拭く。 注：標準スクロース勾配は必要ありません。しかし、これはユーザーの裁量でプロトコルに組み込むこともできます。 各皮膚サンプルの毛包の向きに注意してください。視覚援助のために解剖顕微鏡を使用してください（特にプロトコールを最初に行う人は誰でも）。 OCTで満たされたクライオブラントに皮膚サンプルを挿入し、鉗子を使用してクリッピングされた髪の表面に付着した気泡を除去することによって、皮膚のすべての領域をOCTで平衡させる（ 図2aおよび2b ）。 OCTで満たされたブロックの底にスキンを押して、底と同じ面になるようにします。 注：皮膚は任意の方向に向けることができます。適切な切断手順のために毛包の穀粒が注目されている限り。ブロックが凍結切除のためにクライオスタットに取り付けられると、クライオチップは再配向される。クライオモールド上の毛包の向きをマークする。このステップは、クライオスタットカットのその後の向きを決定するためである。 組織の浮遊と脱落を避けるため、クライオブロックを-80°Cフリーザーの金属板に移します。 目に見えない気泡が皮膚をクライオブラントの表面に浮かせる原因となる可能性があるため、冷凍プロセスを監視してクライオブラッドの底にある皮膚の向きを維持します。 注：冷凍組織を含むクライオモールドは、-80℃で1年以上保存することができ、追加のセクションで再使用することができます。 図1.マウスの皮膚の収穫と固定。 </strong> （ a ）動物の死体の背側領域から皮膚組織を採取した。この領域の毛包は、均等に間隔を置いて整列しているため、矢印で示すように、切開中の最適な向きを可能にする。 （ b ）クライオドールドに適合する適切なサイズの四角形を切断した後、皮膚組織を4％PFAで15分間固定し、PBSで5分間それぞれ2回洗浄した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 2.厚い組織断面 クライオスタットにマウントする準備と組織の向き。 100mLの培養皿に15mLのPBSを調製する。クライオスタットの簡単にアクセス可能な領域に置きます。さらに、1ウェルあたり2.5mLのPBSを含む12ウェルプレートを調製する;の長期保存のためのサンプルに従ってラベル4℃でインキュベートする。セクションを処理するには、鉗子を使用します。 クライオスタットの温度を-20℃に調整する。 注記：温度はセクショニングに影響することがありますが、-20℃で始めるのが良いガイドです。 約2つの毛包の厚い切片を得るために、クライオスタットを150μm厚の切片を切断するように調節する。 注：セクションの厚さは、ユーザーのニーズと分析に使用される顕微鏡の限界に応じて変更できます。 注：サンプルの向きは、毛包が適切な向きである皮膚切片を得るために重要です。これは、クライオスタットブロックに適切に取り付けることによって達成される。セクション平面が毛包の向きと平行であることを確認します （ 図2c ）。前述のように、皮膚サンプル中の断面の正しい向きは、取得される画像の品質を決定する重要なステップです後のステップ。 図2.埋め込み、凍結保存、および切片化。 （ a ） クライオモールド上の毛包（HF）方向を黒い矢印で示していることは、凍結切片作製中の正しい配向のために重要である。 （ b ）毛包の完全な長さが損なわれていない区画を生成するために、区画平面を毛包の配向と整列させる必要がある（ c ）区画を毛包の方向ごとに切断した。クライオモールド。 （ d ）厚い組織断面を金属鉗子で収集し、（ e ）1×PBSを含む100mm培養皿に移した。 （ f ）室温で、PBSはOCを溶解させる.T。白い矢印によって示されるように、厚い組織断面を囲む化合物。セクションは、PBS内で自由に浮遊します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 凍結切除。 クライオスタットを使用して切片を切る。鉗子を使用して、埋め込まれた皮膚を含むOCTを収集します（ 図2d ）。 注：最適な標本の位置決めのために、X、Y、およびZ軸に沿った独立した移動および調整が可能なクライオスタットを使用してください。これにより、理想的に位置合わせされた組織断面の生成が可能になる。 クライオスタットから切片をPBSで満たした100mm培養皿に移し、次のスライスを続ける。サンプルをスライド上に集めないでください（ 図2e ）。 注：室温では、PBSは溶解しますOCTは、鉗子で扱いやすい皮膚スライスを残す（ 図2f ）。 注：厚さ100μmの多くの組織切片を溶解した後、新鮮なPBSが100mm培養皿に必要となり、それに応じて変更することができます。 2.5mLのPBS（ 図3a 、左）で満たされた12ウェルプレートで浮遊皮膚切片を正確に標識されたウェルに移すために鉗子を使用する。 注：4℃では、サンプルを少なくとも2日間保存することができます。切断後の皮膚含有OCTブロックの長期保存のために、新しいOCTの液滴で切断面をシールする。OCT液滴を凍結させた後、使用したOCTブロックをパラフィルムに包んで-80℃冷凍庫に戻す。 3.免疫蛍光標識。 PBSバッファー（0.5％脱脂粉乳、0.25％フィッシュスキンゼラチン、0.5％Triton X-100を補充したPBS）を調製する予めT 2時間、先に5記載の方法。 注：アジ化ナトリウムは、染色バッファーの繰り返し使用のための抗体保存のためにPBバッファーに添加することができます。 1.5 mLのマイクロ遠心チューブにラベルを貼り、チューブあたり500μLのPBバッファーを加えます。注意深く鉗子を使用して、PBSからの皮膚切片をPBS緩衝液を含む別々のチューブに移して遮断する（ 図3a 、右）。すべてのスキンスライスが完全に水没していることを確認してください。マイクロ遠心チューブを室温で1時間、組織の完全性を破壊しないで、毎分10回の振動以下の速度でシーソーロッカー上に置く。 注：シーソーロッカーでは、速度が絡まりを引き起こすため、毎分10回の振動を超えないことが重要です。 マイクロ遠心チューブごとに複数のスライスを追加することは可能ですが、抗体を保存するにはチューブごとにスライスを1つだけ配置します。抗体の使用を減らすには、ボリュームを使用してください250μLであった。 注：必要に応じて、マイクロ遠心チューブを、例えば96穴プレートに交換してください。しかしながら、1.5mLのマイクロ遠心チューブに厚い組織断面を配置することにより、液体の乱れが増強されたため、組織内への最も効果的な抗体の浸透が可能になる。 各皮膚スライスのために別々の1.5mLのマイクロ遠心チューブに標識し、500μLのPB緩衝液および適切な量の一次抗体を加える。ブロッキングの1時間後、抗体を含有する新たに調製したチューブに皮膚切片を移す。スライスを4℃で一晩インキュベートする。 注：この実施例では、以下の一次抗体を使用した：1：50の濃度のFITCラット抗ヒトCD49fおよび1：100の濃度のヤギ抗マウス/ラットインテグリンα8。 翌日、試料あたり500μLのPBSを含む2つの別々の1.5mL微量遠心管を用意する。室温で1時間、皮膚切片を2回洗浄する。e。 適用可能な二次抗体および4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）の適切な濃度のPB緩衝液500μLを含む別々の1.5mL微量遠心チューブを調製する。 注：この例で使用した二次抗体は、1：500の濃度のAlexa Fluor 488ロバ抗ラットIgGおよびAlexa Fluor 555ロバ抗ヤギIgGです。 DAPIを1：100の濃度で使用した。 注意深く、皮膚サンプルを二次抗体およびDAPIを含有するPB緩衝液に移し、ローテーターまたはシェーカー上で室温で1時間、低速で皮膚切片をインキュベートする。 2次抗体とDAPIを含むPBバッファーに4℃で4℃で保存し、アジ化ナトリウムをPBSに加えた場合にはさらに長くしてください。 図3.免疫蛍光entラベリングとマウント。 （ a ）浮遊組織の断面は、4℃で少なくとも2日間12ウェルプレートに保存することができます。免疫蛍光（IF）ラベリングの前に、矢印1で示されるように、ブロッキングのためにPB緩衝液を含む1.5mLマイクロ遠心チューブに目的の組織断面を移す.IF標識のために、ステップ3で詳述された複数ステップ手順に従う。ステップ3の一部は、矢印2で示される、一次抗体溶液、二次抗体溶液、または洗浄バッファーを含有する新たに調製されたマイクロ遠心チューブに組織断面を注意深く移すことを必要とする。（ b ）IF標識後、解剖顕微鏡の助けを借りて、グリセロールの液滴中で切片を解き平滑化する。 （ c ）組織の断面がカバースリップの底に完全に平坦になると、通常の顕微鏡スライドを使用してセクションが取り付けられる。 <ahref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg" target = "_ blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 4.顕微鏡視覚化のための取り付けイメージングする前に、二次抗体およびDAPIを洗い流すために、500μLのPBSを含む別々のマイクロ遠心チューブに皮膚切片を移す。 1,000μLのピペットを使用しますが、ピペットチップの最初の0.5cmを切り、高粘度のグリセロールを適切にピペッティングできるようにします。解剖顕微鏡（ 図3b ）の下に暗い背景に22 x 50 mmカバースリップを置きます。 100％グリセロールの1滴をカバースリップに添加する（ 図3b ）。マイクロ遠心チューブから皮膚切片をグリセロール液滴に移す。解剖顕微鏡と尖った鉗子を使用して、きつく巻いた皮膚のスライスを注意深く巻き戻します。 注：スライスがグリフ内で浮動するとそれは、正常な形状に戻るための組織の自然な傾向を癒すことによって絡み合うことができます。組織の損傷を引き起こす可能性があるので、スライスを不自然にまっすぐにしないでください。 カバー部分には、皮膚部分の全長が適切に向き合って平坦になったら、ティッシュを取り付けます。通常の顕微鏡スライドを使用してください。このステップは、スキンスライスをさらにまっすぐにします。 注記：空気の閉じ込めを避けてください（ 図3c ）。 次の2日以内に、グリセロールにマウントされた皮膚切片をイメージします。 注記：長時間の保管は、組織とイメージングの品質に悪影響を及ぼします。この例では、すべての画像を、20倍対物レンズを用いて直立共焦点顕微鏡で取得した。