Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Alle dierproeven werden onderworpen aan lokale ethische goedkeuring en uitgevoerd onder de voorwaarden van een Britse regeringskantoor. 1. Skin Harvest en Cryopreservation Voorbereidende werkzaamheden. Bereid één 100 mm kweekschotel met 25 ml 4% PFA en twee 100 mm kweekgerechten met 25 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vul rechthoekige afscheidende cryomolds met tweederde met optimale snijtemperatuurverbinding (OCT). Plaats een metalen plaat waarop de cryoblocks in een latere stap kunnen worden geplaatst in de -80 ° C vriezer. Huid oogsten, fixatie en cryopreservering. Knip het dorsale gebied van de dierencadaver met een droge elektrische scheerapparaat. OPMERKING: In dit voorbeeld werden postnatale dag 21 wildtype muizen gebruikt. Oog de gebieden van belang op de huid op. OPMERKING: Het dorsomediale gebied van de muishuid ( <stronG class = "xfig"> Figuur 1a) bevat het hoogste percentage haarfollikels dat evenwijdig is gespannen en uitgelijnd, waardoor optimale oriëntatie voor snede mogelijk is. Het verwijderen van onderliggende niet-dermale weefsels is niet nodig maar kan indien nodig worden uitgevoerd. Trim de geoogste huid in rechthoekige stukken van passende grootte om in de bodem van de cryomold te passen, waarbij rekening wordt gehouden met de richtinggroei van de haarfollikelkoren. OPMERKING: Kleiner huidschijven kunnen makkelijker zijn voor beginners, aangezien ze minder waarschijnlijk zijn tijdens het incubatie- en montageproces. Het hier getoonde voorbeeld is een gebied van 1 cm 2 dorsale huid, die past in een 22 x 30 x 20 mm cryomold ( figuur 2a ). Bevestig de huid bij kamertemperatuur in 25 ml 4% PFA gedurende 10-30 minuten, afhankelijk van de dikte van de huidmonsters ( Figuur 1b ). Was de huidmonsters twee keer in 25 ml PBSVoor tenminste 5 minuten elk ( figuur 1b ). Druppel de huidmonsters op een papieren handdoek om het weefsel van overtollig PBS zorgvuldig af te voeren, wat kan resulteren in kristallisatie tijdens het vriesproces en kan de cryosectie resultaten beïnvloeden. OPMERKING: een standaard sucrose gradiënt is niet nodig. Dit kan echter ook in het protocol worden opgenomen in de discretie van de gebruiker. Wees bewust van de oriëntatie van de haarfollikels voor elk huidmonster. Gebruik een dissectiemicroscoop voor visuele bijstand (vooral iemand die het protocol voor het eerst uitvoert). Steek het huidmonster in de OCT-gevulde cryomold en evenwicht alle gebieden van de huid met OCT door luchtbellen aan de bovenkant van het geknipt haar te verwijderen door middel van tang ( figuren 2a en 2b ). Duw de huid naar de bodem van het OCT gevulde blok, zodat het in de bodem ligt. OPMERKING: De huid kan in elke richting worden georiënteerd, aS lang als de korrel van de haarfollikel wordt genoteerd voor de juiste snijprocedures. De cryomolds worden opnieuw georiënteerd wanneer de blokken aan de cryostat worden gekoppeld voor cryosectie. Merk de hair follicle oriëntatie op de cryomold, aangezien deze stap de latere oriëntatie van de cryostat snede bepaalt. Breng de cryoblocks op de metalen plaat in de -80 ° C vriezer om zwevend en ontwrichting van het weefsel te vermijden. Bewaar het vriesproces om de oriëntatie van de huid onder de cryomold te behouden, aangezien onzichtbare luchtbellen de huid tot het oppervlak van de cryomold kunnen opkomen. OPMERKING: Cryomolds met bevroren weefsel kunnen langer dan een jaar bij -80 ° C worden opgeslagen en kunnen worden hergebruikt voor extra afdelingen. Figuur 1. Oogst en fixatie van de muishuid. </strong> (A) Huidweefsel werd geoogst uit de dorsomediale gebied van het dier kadaver. Haarfollikels in deze regio zijn evenwijdig geplaatst en uitgelijnd en zorgen dus voor een optimale oriëntatie tijdens het snijden, zoals aangegeven door de pijlen. ( B ) Na het knippen van vierkanten van een passende grootte die in de cryomold past, werd het huidweefsel gedurende 15 minuten in 4% PFA gefixeerd en gedurende 5 minuten twee keer in PBS gewassen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Dikte Weefsel Doorsnede Voorbereiding en weefsel oriëntatie om op de cryostat te monteren. Bereid een 100 mm kweekschotel met 15 ml PBS. Plaats het op een gemakkelijk toegankelijke plaats op de cryostat. Voer daarnaast een 12-putjesplaat op met 2,5 ml PBS per putje; Label volgens de monsters voor de lange termijn opslag van de zeeCtions bij 4 ° C. Gebruik pincet om de secties te behandelen. Stel de temperatuur van de cryostat in op -20 ° C. OPMERKING: de temperatuur kan de doorsnede beïnvloeden, maar een goede gids moet beginnen bij -20 ° C. Om afdelingen ongeveer twee haarfollikels dik te maken, pas de cryostaat aan om 150 μm dik te snijden. OPMERKING: De dikte van de sectie kan worden gevarieerd, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker en de beperkingen van de microscoop die gebruikt wordt voor analyse. OPMERKING: De oriëntatie van het monster is van cruciaal belang voor het verkrijgen van huiddelen met haarfollikels in de juiste oriëntatie. Dit wordt bereikt door goed op het cryostatblok te monteren. Zorg ervoor dat het deelvlak parallel is met de haarfollikelrichting ( Figuur 2c ). Zoals eerder vermeld, is de juiste oriëntatie van het snijvlak in het huidmonster een cruciale stap om de kwaliteit van de afbeeldingen te bepalen die worden verworven inEen latere stap. Figuur 2. Inbedding, cryopreservering en sectie. (A) Het markeren van de haarfollikelrichting (HF) op de cryomold, aangegeven door de zwarte pijlen, is belangrijk voor een goede oriëntatie tijdens cryosectie. ( B ) Het deelvlak moet worden afgestemd op de haarfollikeloriëntatie om secties te genereren waarin de volledige lengte van de haarfollikels intact blijft. ( C ) Afdelingen werden gesneden per de hair follicle orientatie die door de zwarte pijlen op de cryomold. ( D ) De dikke weefsel dwarsdoorsneden werden verzameld met metalen tang en ( e ) overgebracht in een 100 mm kweekschotel die 1x PBS bevatte. ( F ) Bij kamertemperatuur lost de PBS de OC weg.T. Verbinding die de dikke weefsel dwarsdoorsneden omringt, zoals aangegeven door de witte pijlen. De secties drijven dan vrij in de PBS. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Cryosectioning. Snijd een sectie met behulp van de cryostat. Gebruik pincet om de OCT te verzamelen die het ingebedde stukje huid bevat ( Figuur 2d ). OPMERKING: gebruik een cryostaat die de onafhankelijke beweging en aanpassing mogelijk maakt langs de axes X, Y en Z voor een optimale positionering van het monster. Dit zorgt voor het genereren van ideaal uitgelijste weefsel dwarsdoorsneden. Breng het gedeelte uit de cryostaat over in de 100 mm kweekschaal, gevuld met PBS, en ga verder met de volgende plak. Verzamel de monsters niet op een dia ( Figuur 2e ). OPMERKING: bij kamertemperatuur zal de PBS oplossenDe OCT, waardoor de plakken die makkelijk te hanteren zijn met handvaten ( figuur 2f ) verlaten. OPMERKING: Verse PBS kan nodig zijn in de 100 mm kweekschotel na het oplossen van veel weefselsecties 100 μm dik en kunnen dienovereenkomstig worden gewijzigd. Gebruik pincet om de drijvende huidafdelingen over te brengen naar de goed gemarkeerde put in een 12-vel plaat gevuld met 2,5 ml PBS ( Figuur 3a , links). OPMERKING: bij 4 ° C kunnen de monsters gedurende minstens twee dagen worden opgeslagen. Voor de langdurige opslag van OCT-blokken na het snijden van de huid, sluit het snijvlak met een druppel verse OCT. Na het vriezen van de OCT-druppel, draai het gebruikte OCT-blok in parafilm en plaats deze terug in de -80 ° C diepvriezer . 3. Immunofluorescente etikettering. Bereid de PB buffer (PBS aangevuld met 0,5% schuimmelkpoeder, 0,25% vishuidgelatine en 0,5% Triton X-100) bij leasT 2 uur van tevoren, zoals eerder beschreven 5 . OPMERKING: Natriumazide kan worden toegevoegd aan PB buffer voor het behoud van antilichamen voor het herhaalde gebruik van de kleurbuffer. Meng 1,5 ml microcentrifugebuizen en voeg 500 μL PB buffer per buis toe. Gebruik pincet zorgvuldig om de huidplakken van de PBS in aparte buizen over te brengen die de PB-buffer bevatten om te blokkeren ( Figuur 3a , rechts). Zorg ervoor dat alle huidplakken volledig ondergedompeld zijn. Plaats de microcentrifugebuizen op een zaagzaagrooster bij snelheden van niet meer dan 10 oscillaties per minuut, die de weefselintegriteit niet moeten verstoren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de snelheid niet meer dan 10 oscillaties per minuut overschrijdt op de zaagknijper, aangezien het in beweging komt. Terwijl het mogelijk is om meer dan een snij per microcentrifugebuis toe te voegen, om antilichamen op te slaan, plaatst u slechts een snij per buis. Gebruik een volume om het antilichaamgebruik te verminderenVan 250 μl. OPMERKING: vervang eventueel microcentrifugebuizen met bijvoorbeeld 96-putjesplaten. Echter, de plaatsing van de dikke weefsel dwarsdoorsneden in 1,5 ml microcentrifuge buizen zorgt voor de meest effectieve antilichaam penetratie in het weefsel als gevolg van de verhoogde vloeistof verstoring. Label aparte 1,5 ml microcentrifugebuizen voor elke huidschijf en voeg 500 μl PB buffer en de geschikte hoeveelheid primaire antilichaam toe. Na 1 uur blokkeren, verplaats de huidplakken in de vers bereide buizen die de antilichamen bevatten. Incubeer de plakjes bij 4 ° C overnacht. OPMERKING: In dit voorbeeld werden de volgende primaire antilichamen gebruikt: FITC rat anti-menselijke CD49f bij een concentratie van 1:50 en geit anti-muis / rat integrin alpha 8 bij een concentratie van 1: 100. De volgende dag bereiden twee afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuizen die 500 μl PBS per monster bevatten. Was de snijplakken twee keer gedurende 1 uur bij kamertemperatuure. Bereid aparte 1,5 ml microcentrifugebuizen die 500 μl PB buffer bevatten met de juiste concentratie van toepasselijke secundaire antilichamen en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). OPMERKING: De secundaire antilichamen die in dit voorbeeld worden gebruikt zijn Alexa Fluor 488 ezel anti-rat IgG en Alexa Fluor 555 ezel anti-geiten IgG in een concentratie van 1: 500. DAPI werd gebruikt bij een concentratie van 1: 100. Verzorg de huidmonsters zorgvuldig in de PB buffer, die het secundaire antilichaam en DAPI bevat, en incubeer de huidschijven bij kamertemperatuur gedurende 1 uur bij een lage snelheid op een rotator of shaker. Bewaar de plakjes bij 4 ° C in de PB buffer die het secundaire antilichaam en DAPI bevat gedurende maximaal vier dagen, en mogelijk langer als natriumazide aan de PBS wordt toegevoegd. Figuur 3. ImmunofluorescEtikettering en montage. (A) De drijvende weefsel doorsneden kunnen worden opgeslagen in 12-putsplaten gedurende ten minste twee dagen bij 4 ° C. Voordat immunofluorescerende (IF) etikettering de overige delen van het weefsel overbrengen in 1,5 ml microcentrifugebuizen die PB buffer bevatten om te blokkeren, zoals aangegeven door pijl 1. Voor IF-etikettering, houden u aan bij de multi-step procedure die in stap 3 is uitgewerkt. Onderdeel van stap 3 vereist de zorgvuldige overdracht van de weefsel dwarsdoorsneden in vers bereide microcentrifugebuizen die primaire antilichaamoplossing, secundaire antilichaamoplossing of wasbuffer bevatten, die door pijl 2 wordt aangegeven. ( B ) na de IF-etikettering, Secties worden ontrafeld en platgedraaid in een druppel glycerol, met behulp van de hulp van een dissectiemicroscoop. ( C ) Zodra het weefsel dwarsdoorsnede volledig op de bodem van een deklaag is afgemaakt, wordt er een regelmatige microscoopschuif gebruikt om het gedeelte te monteren. <aHref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. 4. Montage voor microscopische visualisatie Voorafgaand aan beeldvorming, overdracht van de huidplakken naar aparte microcentrifugebuizen die 500 μl PBS bevatten om de secundaire antilichamen en DAPI weg te wassen. Gebruik een 1000 μL pipet, maar snijd de eerste 0,5 cm van de pipettip af om de juiste pipettering van het sterk viskeuze glycerol mogelijk te maken. Plaats een 22 x 50 mm deklaag op een donkere achtergrond onder een dissectiemicroscoop ( Figuur 3b ). Voeg één druppel 100% glycerol op de deklaag toe ( Figuur 3b ). Breng de huidschijf van de microcentrifugebuis over op de glyceroldruppel. Gebruik de dissectiemicroscoop en de spitse tang om de huidschijfjes die opgerold zijn, zorgvuldig te ontspannen. OPMERKING: als de schijf in de gly drijftCerol druppel, kan het untangled worden door de natuurlijke geneigdheid van het weefsel te coaxeren om terug te keren naar zijn normale vorm. Doe niet de onnatuurlijke rechthoek van de plak, want dit kan schade aan het weefsel veroorzaken. Monteer het weefsel zodra de gehele lengte van het huidgedeelte correct is georiënteerd en plat op de deklaag Gebruik een regelmatige microscoopschuif. Deze stap zal de huidschijf verder uitlijnen. OPMERKING: Vermijd luchtbevestiging ( Figuur 3c ). Afbeelding in de glycerol-gemonteerde huid secties binnen de komende twee dagen. OPMERKING: Langdurige opslag heeft een weerslag op de weefsel- en beeldkwaliteit. In dit voorbeeld werden alle beelden verkregen met een oprechte confocale microscoop met een 20x doelstelling.