C. elegans кишечника как модель для межклеточных люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза на уровне одной ячейки: маркировка Пятнать антитела, RNAi потери функции анализа и обработки изображений

Поколение клеточном и субклеточном асимметрии, таких как формирование поляризованной мембраны доменов, имеет решающее значение для морфогенеза и функции клеток, тканей и органов¹. Исследования на поляризованной мембраны биогенеза в эпителия остаются технической проблемой, поскольку направленного изменения в распределении субцеллюлярные компоненты зависят от нескольких подряд и совпадающих внеклеточные и внутриклеточных сигналов, которые трудно отделить в большинстве моделей и сильно зависят от модели системы. Модели представленные здесь – однослойная Caenorhabditis elegans кишечника – это ткани изысканная простота. Вместе с одной ячейкой C. elegans выделительной канал (см. сопроводительный документ на поляризованной мембраны биогенеза в C. elegans выделительной канал)², он предоставляет несколько уникальных преимуществ для идентификации и характеристика молекулы, необходимые для биогенеза поляризованной мембраны. Сохранению молекулярных полярности сигналы от дрожжей человеку сделать этот простой беспозвоночных орган отлично «в vivo ткани палата» на вопросы об эпителиальных полярности которые имеют непосредственное отношение к системе человека, который до сих пор слишком комплекс для обеспечения визуального рассечение этих событий на сингл ячейки уровня в естественных условиях.

Хотя несколько сохранившихся полярности сигналы от матрица (1 extracelluar, (2 плазматической мембраны и его узлов и (3) внутриклеточных везикулярного людьми были определены³, основополагающие принципы их интеграции в процессе Поляризованные эпителиальных мембраны и ткани биогенеза является плохо понимали⁴. Модели классических одноклеточных в vivo (e.g.S. cerevisiae и C. elegans зиготы) играют важную роль в определении принципов поляризованные деление клеток и передней задней полярности и определили критических связанный мембранами полярности детерминанты (небольшой GTPases/CDC-42, разметка дефектных PARs)^5,6, но они зависят от уникальных симметрии сигналы (бутон шрам, спермы запись) и отсутствие безопасного соединения apicobasal мембраны домены и, предположительно, соответствующий внутриклеточных apicobasal, сортировка машин. Наши текущие знания о организации поляризованные оборота эпителия, однако, главным образом опирается на млекопитающих 2D монокультур⁷, которых недостает физиологических внеклеточные и развития сигналы, которые могут изменить позиции мембраны домены и направления торговли людьми траекторий (переход от 2D к 3D в vitro системах культуры только достаточно поменять полярность мембраны в клетках MDCK (Мадин-Дарби собак почек))⁸. В естественных условиях развития исследования по эпителиальных полярности в беспозвоночных модельных организмов первоначально проводились в плоского эпителия, например в эпидермисе Drosophila melanogaster , где они выявили решающий вклад Джанкшен динамики миграции поляризованные ячейки и ячейки листа движения⁹и endocytic торговли полярности обслуживания¹⁰. 3D в пробирке и в естественных условиях анализа люмен морфогенеза в трубчатых эпителия в MDCK клетках и в C. elegans ЖКТ, соответственно, недавно определили требования внутриклеточных людьми для де Нову (верхушечно) домен и биогенеза люмен и позиционирования^11,12,13. Толщина от трубчатые (по сравнению с плоским) эпителиальных клеток является преимуществом для 3D анализа субцеллюлярные асимметрии так как он позволяет улучшенные визуальные различия верхушечно lumenal мембрану, apico боковое развязок, боковые мембраны и позиции внутриклеточных органелл. Эти визуальные преимущества, в C. elegans модель добавляет параметр в vivo , развития оси, прозрачность, простота план тела, инвариантные и определенных клеток линии, аналитический (генетических) и дополнительные преимущества, описанные ниже.

C. elegans сам является аскариды трубчатой структуры, чьи прозрачности и простая архитектура сделать его также трубчатые внутренних органов непосредственно доступными для визуального анализа трубки и Люмене морфогенеза. Двадцать клетки его кишечника (по случаю 21 или 22 клетки)¹⁴ являются производными от одного прародителя ячейки (E) и развиваются из эпителия двуслойная путем интеркаляции шаг в двустороннем симметричные трубку девяти INT колец (четыре клетки в первое кольцо; Рис.1 схема)^14,,1516. Кишечника тканей и линии анализ, первоначально определяется Номарски оптики через ядерных тождества¹⁷и впоследствии микроскопии флуоресцирования через обозначенные мембран, оказывает критическое понимание его морфогенеза, в частности клеток автономной и клеток неавтономной требования к его направленного клеточных делений и движений (например, интеркаляции, справа слева асимметрии, передняя и задняя труба вращения)^14,18 . Ранние эндодермы клеток спецификации и гена регулирования сети, контроль развития этого органа клоновых модели являются хорошо характеризуется^19,20. В центре внимания здесь, однако, находится на анализе поляризованной мембраны и биогенеза Люмене в одиночных клетках трубчатых и внутриклеточных асимметрий endomembranes, цитоскелета структур и органеллы, которые сопровождают этот процесс. Анализ способствует простота этой трубки, где все апикальной мембраны (на ультраструктурные уровне отличается микроворсинки) сталкиваются просвета и все базальной мембраны торцевые поверхности наружной трубы, с боковой мембраны связаться друг с другом, отделенный от апикального мембраны развязок (схемарис 1 ; см. ссылки (^2116,) для C. elegans-конкретной организации туго и adherens соединения компонентов). Апикальном мембрана биогенеза таким образом совпало с люмен морфогенеза. Кроме того размер взрослых клеток кишечника – крупнейший клетки этот зверек (с исключением выделительной ячейки) – примерный размер клеток млекопитающих, позволяющие в vivo визуального отслеживания субцеллюлярные элементов, например везикул траектории, которые обычно является попытка в пробирке в культуры блюдо.

Для целей данного анализа клеточном и субклеточном соответствующие маркировки имеет решающее значение. Кишечные Эндо – или плазматической мембраны домены, перекрестки, цитоскелетаструктуры, ядер и других внутриклеточных органелл могут быть визуализированы, снабдив их конкретные молекулярные компоненты. Многие такие компоненты были и продолжают быть обнаружены (Таблица 1 дает несколько примеров и относится к ресурсам). Например различные молекулы, отличающие трубчатых или везикулярного отсеков кишечных endomembrane системы, от ER Гольджи через пост Гольджи везикулы в плазматической мембране, были определены²². Конкретные белки (а также липиды и сахара) может либо быть помечены прямо или косвенно через привязки белков. Этот протокол посвящен в situ антитело пятная фиксированной образцов, один из двух стандартных методов маркировки (см сопроводительный документ на выделительную канал tubulogenesis для описания других техника² – в естественных условиях маркировки через флуоресцентный протеин сплавливания – которые непосредственно применимо к кишечника; Таблица 2 примеры кишечника конкретных промоутеров, которые могут использоваться для привода выражение такого синтеза белков в кишечнике). Двух – или несколько маркировки с любой подход, или сочетанием обоих плюс дополнительные химические окраски, позволяет более углубленного визуальные резолюции и изучение пространственных и временных изменений в совместно локализации и набор конкретных молекулы или внутриклеточных компонентов (Рисунок 2). Фиксации и окраски процедуры, описанные в этом протокол поддержки сохранения зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) маркировки во время процедуры иммуноокрашивания. Для изображений, ключевые точки обнаружения и характеристика tubulogenesis фенотипов через микроскопические стандартных процедур (рассечения и конфокальной микроскопии флуоресцирования), описалРисунок 3, 4 (). Это может распространяться на более высокое разрешение изображений подходы, для экземпляра сверхразрешение микроскопии и передачи электронной микроскопии (здесь не описывается).

Сила ключа этой системы является способность анализировать полярности в отдельных ячейках на разных этапах своего развития, от эмбриогенеза до зрелого возраста. Например домен и Люмене биогенеза апикальном мембрана может отслеживаться на протяжении развития на уровне одной ячейки через маркировки с ERM-1, высоко сохранены мембраны актина компоновщика Эзрин-Radixin-Moesin семьи^23,24 . ERM-1 визуализирует биогенеза апикальной мембраны (1) во время эмбрионального трубки морфогенеза, когда это происходит параллельно с поляризованными деление клеток и миграции (клетки передвигаться вершине люмен во время интеркаляции)¹⁵; (2) во время позднего эмбриональных и личинок трубки расширение, которое продолжается в отсутствие деления клеток или миграции; и (3) в кишечнике взрослых, где поляризованной мембраны домены поддерживаются (рис. 1). В эпителии расширения после митотическая личиночной de novo поляризованной мембраны биогенеза таким образом может быть отделена от поляризации ткани морфогенеза, что невозможно в большинстве моделей эпителиальных полярности в vivo и in vitro , числе с одной ячейкой резолюции (например 3D MDCK кисты модель⁸). С маркировка для других компонентов, этот параметр обеспечивает возможность (особенно на L1 личиночной стадии, когда клетки имеют более высокий коэффициент цитоплазме/ядро) отличить эти внутриклеточные изменения, которые являются специфическими для поляризованной мембраны биогенеза ( например переориентации торговли людьми траекторий) от тех сопутствующе обстоятельств необходимых для поляризованные деление клеток и миграции.

Генетическая универсальность C. elegans хорошо известно²⁵и делает его мощная модель системы для молекулярного анализа любых биологических вопрос. Исследование на морфогенеза, например, можно начать с одичал тип деформации, трансгенных штамм, где структура интереса (например мембраны) помечается с флуоресцентных маркеров, или потеря получить из функции или мутант с дефектом в этом структура. Типичный обратный генетическое исследование может генерировать мутант, где удаляется гена интереса в микрофлорой (например , целевых удаления), изменена мутагенез (обычно производит точечные мутации с последующей потерей, сокращение или увеличение функции гена) или где его транскрипт уменьшается на РНК-интерференции. Простота RNAi кормления в C. elegans²⁶ также поддается разработке целенаправленных экранов, которые изучить более крупной группы генов интерес. Возможно сильной генетической модели организма является способность поведения в естественных условиях вперед экраны (например мутагенеза, систематических или геном общесистемной RNAi экраны), разрешающие расследование беспристрастной молекулярных причина фенотип интерес. К примеру, беспристрастной visual C. elegans RNAi tubulogenesis экран, начиная с трансгенных животных с ERM-1-меченых апикальной мембраны, обнаружили интригующий реверсивные кишечных полярности преобразования и внематочная люмен фенотип, используемые Здесь в качестве примера для этого типа анализа. Этот экран истощение гликосфинголипиды (GSLs; облигатные мембранных липидов, выявленных через их GLS-биосинтетических ферментов) и компоненты Клатрин пальто везикул и его AP-1 адаптер названы конкретные молекулярные дефекты, вызывая этом полярность фенотип преобразования, тем самым характеризуя эти людьми молекул как в естественных условиях Кии апикальном мембрана полярности и Люмене позиционирования^12,13. Когда начиная с конкретных генетических мутаций/морфогенеза фенотип, такие экраны (или одной генетической/RNAi взаимодействия эксперименты) можно также проанализировать функционального взаимодействия между двумя или несколькими генов интерес (см. сопроводительный документ на выделительную ²канала в качестве примера такого анализа). Этот протокол фокусируется на РНК-интерференции, который, в дополнение к его способности напрямую идентифицировать ген, потеря которых причины фенотипа вперед экранах, предоставляет особые преимущества для анализа морфогенеза. Поскольку продукты гена, направляя морфогенеза часто работают в зависимости от дозы моды, RNAi обычно успешно в генерации спектр фенотипов. Способность создавать информативные частичной потери функции фенотипов также помогает для решения этой проблемы, что большинство важных tubulogenesis генов имеют важнейшее значение и что их потери вызывают бесплодие и ранних эмбриональных летальность. Этот протокол включает условное RNAi стратегии для преодоления этой трудности и предлагает способы оптимизации поколения широкого спектра фенотипы, например аллельные серии, производимые мутагенеза.