C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

הדור של הסלולר, subcellular asymmetries, כגון היווצרות קרום מקוטב תחומים, חיונית מורפוגנזה והתפקוד של תאים, רקמות ואיברים¹. מחקרים על קרום מקוטב להן ב- epithelia להישאר אתגר טכני, מאז כיוונית שינויים בחלוקת רכיבי subcellular תלויים מרובות רצופות, וצירוף חוץ-תאית, תאיים אותות? קשה להפריד בין רוב הדגמים ותלויות חריפה במערכת מודל. המודל המוצג כאן – את הכוללים שכבה אחת Caenorhabditis elegans המעי – הוא רקמה של פשטות משובח. יחד עם החד-תאיים C. elegans excretory תעלה (ראה המלווה נייר על קרום מקוטב להן בתוך התעלה excretory C. elegans )², הוא מספק מספר יתרונות ייחודיים לצורך הזיהוי ו אפיון של מולקולות הדרושות להן קרום מקוטב. שימור רמזים קוטביות מולקולרית של שמרים לאדם להפוך איבר הגעה פשוטה זה מצוין“ויוו רקמות הקאמרית” שאלות לגבי אפיתל קוטביות שאינן רלוונטיות ישירות למערכת האנושית, שהיא עדיין יותר מדי מתחם כדי לאפשר את הקרע חזותי של אירועים אלה על הסינגל תא רמה בתוך vivo.

למרות מספר רמזים שנשמרת קוטביות מטריצה extracelluar (1), (2) קרום פלזמה, צמתי, והאטרקציות (3) vesicular וגדילת היה להיות מזוהה³, עקרונות היסוד של שילובם בתהליך של מקוטב להן קרום של רקמת אפיתל הוא ממעטים להבין⁴. קלאסית תא בודד ויוו הדגמים (e.g.S. cerevisiae וגם את הזיגוטה C. elegans ) סייעו בהגדרת עקרונות מקוטב חלוקת התא הקדמי-אחוריים קוטביות, זיהו קריטי ממברנה-הקשורים קוטביות גורמים (קטן GTPases/CDC-42, את PARs תקינה למחיצות)^5,6, אבל הם תלויים סימטריה ייחודי שבירת רמזים (ניצן הצלקת, הזנת הזרע) וחסרי מאובטחת-צומת apicobasal ממברנה תחומים, ככל הנראה, את apicobasal תאיים המתאימים מיון מכונות. הידע הנוכחי שלנו אודות ארגון מקוטב בבני אדם epithelia, עם זאת, בעיקר מסתמך על monocultures 2D בתרבית של⁷, אשר חסרים פיזיולוגיים רמזים חוץ-תאית והפיתוחים שיכולים לשנות עמדות של קרום תחומים וכיוונים של מסלולי הסחר בבני אדם (מתג ועד לכרטיסי תלת-ממד in vitro לקשרי תרבות מערכות לבד מספיק כדי היפוך קוטביות הממברנה בתאי MDCK (מדין טומי הכלבי הכליה))⁸. In vivo מחקרים התפתחותיים על קוטביות אפיתל דגם הגעה אורגניזמים נערכו תחילה epithelia שטוח, למשל באפידרמיס דרוזופילה melanogaster , איפה הם זיהו את התרומה קריטי צומת dynamics נדידת תאים מקוטב, תנועה לתא גליון⁹, ואת endocytic סחר קוטביות תחזוקה¹⁰. תלת-ממד במבחנה וניתוח ויוו של לומן מורפוגנזה ב epithelia צינורי בתאים MDCK ו במעי C. elegans , בהתאמה, לאחרונה זיהו את הדרישה של וגדילת עבור דה נובו תחום (הפסגה) ו לומן להן והמיקום^11,12,13. העובי של הכרישים (לעומת שטוח) לתאי האפיתל היא יתרון לניתוח 3D של subcellular asymmetries מאז היא מתירה הבחנה חזותית מעולה של קרום הפסגה-lumenal, apico-לרוחב צמתי, ממברנה לרוחב, ו עמדות organelles תאיים. יתרונות אלו חזותי, דגם C. elegans מוסיף vivo בתוך ההגדרה, ציר התפתחותית, שקיפות, הפשטות של תוכנית גוף, שושלת היוחסין של תאי קבוע ומוגדר, אנליטי (גנטית) ויתרונות נוספים המתוארים להלן.

C. elegans עצמו הוא התולעת העגולה של מבנה צינורי שקיפות של מי ואדריכלות פשוטה להפוך את האיברים הפנימיים בדומה צינורי נגישים ישירות לניתוח חזותי של לומן ובשעות מורפוגנזה. תאי עשרים שלו המעי (21 או 22 תאים מדי פעם)¹⁴ נגזרים מתוך תאים ובתאים יחיד (E) ולפתח של האפיתל שכבות כפול על ידי העיבור צעד לתוך צינור נשימה סימטרית של תשע טבעות INT (ארבעה תאי הטבעת הראשונה; איור 1 סכמטי)^14,15,16. ניתוח שושלת היוחסין ורקמות של המעי, בתחילה נקבע על-ידי Nomarski אופטיקה באמצעות זהויות גרעיני¹⁷ולאחר מכן על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ דרך ממברנות שכותרתו, סיפקה קריטי תובנות מורפוגנזה שלה, ב מסוים הדרישות תא-אוטונומי, תא-שאינם-אוטונומי שלו חלוקות תאים כיוונית, תנועות (למשל, העיבור, מימין asymmetries, סיבוב התחתית anterior ואת אחורי)^14,18 . בתחילת תא endodermal מפרט את רשת גנטית שליטה על התפתחות איבר המשובטים מודל זה טוב מאופיין^19,20בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. במוקד הדיון כאן, זאת, על הניתוח של קרום מקוטב ושל לומן להן בתאים צינורי יחיד, ושל את asymmetries תאיים של endomembranes, מבנים cytoskeletal organelles המלוות תהליך זה. הניתוח בהנחייתם של הפשטות של הרכבת התחתית, איפה כל הפסגה ממברנות (ברמה ultrastructural מכובד על-ידי microvilli) מול לומן עם ממברנות הבזליים כל הפנים השטח צינור חיצוני, עם ממברנות לרוחב פנייה אל אחד את השני, הופרדו קרום הפסגה על-ידי צמתים (מפרטים טכנייםאיור 1 ; ראה הפניות (^16,21) עבור C. elegans-ארגון ספציפי חזק ורכיבים צומת adherens). ממברנה הפסגה להן היא לפיכך חופפת מורפוגנזה לומן. יתר על כן, גודל תאי המעי למבוגרים – התאים הגדול של חיה קטנה זו (עם חריג של התא excretory) – אומדן גודל תא יונקים, המתיר ויוו חזותי המעקב של אלמנטים subcellular, למשל מסלולים שלפוחית, זה בדרך כלל ניסיון במבחנה בקערה תרבות.

למטרת ניתוח זה הסלולר, subcellular, תיוג מתאים הוא קריטי. מעיים אנדו – או -קרום פלזמה תחומים, צמתים, cytoskeletalעל-ידי תיוג ומרכיביהם מולקולרי מסוים, ניתן לאבחן מבנים, גרעינים, organelles subcellular אחרים. רכיבים רבים כאלה כבר שאפיינו וממשיכים להתגלות (טבלה 1 נותן כמה דוגמאות, מתייחס משאבים). למשל, מולקולות שונים הבחנה התאים צינורי ו/או vesicular של המערכת endomembrane מעיים, מחדר המיון גולג’י דרך פוסט-גולג’י שלפוחית על קרום פלזמה, היה מזוהה²². ספציפי חלבונים (כמו גם שומנים, סוכרים) יכול גם להיקרא במישרין, או בעקיפין באמצעות איגוד חלבונים. פרוטוקול זה מתמקד בחיי עיר נוגדן מכתים של דגימות קבוע, אחד של שתי טכניקות תיוג סטנדרטי (לראות את הנייר הנלווה על תעלת excretory tubulogenesis לקבלת תיאור של אחרים בטכניקת² – ויוו תיוג באמצעות חלבון פלואורסצנטי fusions – אשר חל ישירות המעי; טבלה 2 מספק דוגמאות של היזמים המעי ספציפי שיכול לשמש לנסוע ביטוי של חלבונים היתוך כזה המעי). זוגי – או תיוג מרובים עם גישה או, או עם שילוב של שניהם פלוס נוספים כימי מכתים, מאפשר יותר מעמיק רזולוציה ויזואלית, בחינת שינויים יכולות בלוקליזציה שיתוף בגיוס ספציפי מולקולות או מרכיבים subcellular (איור 2). את הקיבעון, צביעת בהליכים המתוארים תחת תמיכה בפרוטוקול שימור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תיוג במהלך הליכי immunostaining. עבור הדמיה, מפתח נקודות הזיהוי ותיאר אפיון tubulogenesis פנוטיפים באמצעות הליכים סטנדרטיים מיקרוסקופיים (קרינה פלואורסצנטית ויבתר ו קונאפוקלית מיקרוסקופ) הם (איור 3, 4). אלה ניתן להרחיב ברזולוציה גבוהה יותר הדמיה גישות, עבור מופע superresolution מיקרוסקופ ושידור מיקרוסקופ אלקטרונים (לא המתוארים כאן).

בחוזק המפתח של מערכת זו הוא היכולת לנתח קוטביות בתאים בודדים בשלבים התפתחותיים שונים, מן מופרה דרך לבגרות. למשל, ממברנה הפסגה לומן והתחום להן ניתן לעקוב במהלך פיתוח ברמה תא בודד באמצעות תיוג עם ממברנה שנשמרת מאוד-אקטין מקשר של אזרין-Radixin-Moesin משפחה^{23,24, ERM-1} . ERM-1 מדמיין להן קרום הפסגה (1) במהלך מורפוגנזה צינור עובריים, כאשר היא מתרחשת יחד עם חלוקת התא מקוטב, העברה (להעביר תאים apically סביב לומן בזמן העיבור)¹⁵; (2) במהלך מאוחר שלוחה שפופרת של זחל ממשיך בהיעדרו של חלוקת התא או ההעברה; (3) במעי למבוגרים, שבו קרום מקוטב תחומים נשמרות (איור 1). בתוך האפיתל זחל שלאחר mitotic מתרחבת, דה נובו מקוטב ממברנה להן ובכך ניתן להפריד מן מורפוגנזה רקמות מקוטב, שאינו אפשרי רוב הדגמים ב- vivo ו- in vitro לקשרי קוטביות אפיתל, כולל עם רזולוציה תא בודד (למשל 3D MDCK ציסטה דגם⁸). עם תיוג עבור רכיבים אחרים, הגדרה זו מספקת את ההזדמנות (במיוחד ב- L1 הזחל כאשר התאים יש יחס ציטופלזמה/גרעין גבוה יותר) כדי להבחין בין שינויים תאיים אלה שהינם ספציפיים מקוטב (להן קרום למשל ולהתפכחות של מסלולי הסחר בבני אדם) אלה/ת הנדרשים עבור חלוקת התא מקוטב והעברה.

צדדיות גנטי של C. elegans הוא ידוע²⁵והופכת אותו מערכת מודל רב עוצמה לניתוח מולקולרית של כל שאלה ביולוגית. מחקר על מורפוגנזה, למשל, יכול להתחיל עם זן פראי-סוג, זן מהונדס שבו המבנה של הריבית (למשל קרום) נקראת עם סמן פלורסנט, או עם מוטציה הפסד או רווח-של-פונקציה עם פגם בזה מבנה. מחקר גנטי הפוכה טיפוסי עשוי ליצור מוטציה איפה הגן עניין נמחק ב germline (למשל על ידי מחיקה יישוב), השתנה על-ידי מוטגנזה מכוונת (בדרך כלל לייצר מוטציות נקודה עם אובדן הסוגר, הפחתה או הגברה בפונקציה של הגן), או איפה התעתיק שלו הוא מופחת על ידי RNAi. הקלות של RNAi מאכילים ב- C. elegans²⁶ גם משאיל את עצמו בעיצוב של מסכי יישוב לבחון קבוצה גדולה יותר של הגנים של עניין. הכוח החזק ביותר ניתן לטעון של אורגניזם מודל גנטי הוא היכולת לנהל ויוו קדימה המסכים (למשל מוטגנזה מכוונת, מסכי שיטתית או ברמת הגנום RNAi) כי היתר חקירה לא משוחדת על הסיבה מולקולרית הפנוטיפ של ריבית. למשל, לא משוחדת visual C. elegans RNAi tubulogenesis מסך, החל חיה הטרנסגניים עם ממברנות הפסגה ERM 1-שכותרתו, גילו של המרה קוטביות מעיים הפיך מסקרן פנוטיפ לומן חוץ רחמי, המשמש כאן כדוגמה עבור סוג זה של ניתוח. מסך זה זוהה דלדול של glycosphingolipids (GSLs; ממברנה גידול שומנים, מזוהה באמצעות אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר GLS שלהם) ורכיבים של clathrin המעיל של שלפוחית, מתאם AP-1 שלו הליקויים מולקולרי מסוים גורם קוטביות זו פנוטיפ ההמרה, ובכך אפיון אלה סחר מולקולות כמו ויוו רמזים עבור ממברנה הפסגה קוטביות ו לומן מיצוב^12,13. כאשר החל הפנוטיפ מוטציה גנטית ספציפית/מורפוגנזה, מסכי כזה (או ניסויים יחיד האינטראקציה הגנטית/RNAi) ניתן גם לבחון פונקציונלי האינטראקציות בין גנים מרובים או עניין (ראה המלווה נייר על excretory תעלת לקבלת דוגמה של ניתוח כזה)². פרוטוקול זה מתמקד RNAi אשר, בנוסף היכולת שלה ישירות לזהות את הגן אובדן אשר גורמת פנוטיפ של המסכים הקדמיים, מספק יתרונות ספציפיים לניתוח של מורפוגנזה. מאז הגן מוצרים בימוי מורפוגנזה לעיתים קרובות עובדים באופן תלוי מינון, RNAi הוא מצליח בדרך כלל יוצר קשת של פנוטיפים. היכולת להפיק פנוטיפים חלקית-אובדן-של-פונקציה אינפורמטיבי מסייעת גם לטפל בבעיה כי הרוב המכריע של גנים tubulogenesis חשוב הם חיוניים, כי ההפסדים שלהם לגרום עקרות, lethality עובריים מוקדם. פרוטוקול זה כולל אסטרטגיות RNAi מותנה כדי להתגבר על הקושי הזה, מציע דרכים כדי למטב את הדור של קשת רחבה של הפנוטיפים, כגון סדרות allelic המיוצר על ידי מוטגנזה מכוונת.