التنميط المضادة لل Neu5Gc مفتش في المصل البشري مع سيالوغليكان ميكروأري الفحص
Summary
ويمكن إجراء مقايسة ميكروأري سيالوغليكان لتقييم الأجسام المضادة لمكافحة neu5Gc في الأمصال البشرية، مما يجعل من المحتمل فحص الإنتاجية العالية التشخيص للسرطان وغيرها من الأمراض المزمنة التي تسببها التهابات الإنسان.
Abstract
وتغطي الخلايا مع عباءة سلاسل الكربوهيدرات (غليكانز) التي تتغير عادة في السرطان والتي تشمل الاختلافات في تعبير حمض السياليك (سيا). هذه هي السكريات الحمضية التي لديها العمود الفقري 9-الكربون وأن غليكانز الفقاريات كاب على أسطح الخلايا. اثنين من أشكال سيا الرئيسية في الثدييات هي حمض N- ستيلنورامينيك (Neu5Ac) وشكله الهيدروكسيلية، N -glycolylneuramin حمض (Neu5Gc). البشر لا يمكن أن تنتج neu5Gc الذاتية بسبب تعطيل الجين ترميز سيتيدين 5'monophosphate-Neu5Ac (سمب-Neu5Ac) هيدروكسيلاز (سماه). يتم الحصول على Neu5Gc الخارجية من قبل الخلايا البشرية من خلال الاستهلاك الغذائي من اللحوم الحمراء ومنتجات الألبان ويظهر لاحقا على غليكانز متنوعة على سطح الخلية، وتراكم معظمها على سرطان. ونتيجة لذلك، والبشر لديها تعميم الأجسام المضادة لمكافحة Neu5Gc التي تلعب أدوارا متنوعة في السرطان وغيرها من الأمراض المزمنة بوساطة التهاب والتي أصبحت المحتملة التشخيص والعلاجية تاrgets. هنا، نحن تصف عالية الإنتاجية سيالوغليكان ميكروأري فحص لتقييم هذه الأجسام المضادة لمكافحة Neu5Gc في المصل البشري. تحتوي على غليكانز ne5Gc وأزواجها مطابقة من الضوابط (nely5Ac التي تحتوي على غليكانز)، مع كل الأمين الأساسي الأساسية، مرتبطة تساهمية الشرائح الزجاجية المغلفة الايبوكسي. نحن مثال على طباعة 56 الشرائح في شكل 16 جيدا باستخدام طابعة نانو محددة قادرة على توليد ما يصل إلى 896 المصفوفات في الطباعة. كل شريحة يمكن استخدامها لفحص 16 عينات مختلفة من مصل الدم البشري لتقييم المضادة لل Neu5Gc خصوصية الأجسام المضادة، وكثافة، والتنوع. يصف البروتوكول تعقيد هذه الأداة قوية ويوفر التوجيهي الأساسي لتلك التي تهدف إلى التحقيق في الاستجابة لمضاد الكربوهيدرات الغذائي Neu5Gc في عينات سريرية متنوعة في شكل صفيف.
Introduction
سياس هي السكريات الحمضية التي تغطي سلاسل غليكان على بروتين سكري سطح الخلية والشحميات السكرية في الفقاريات. يتم تعديل التعبير سيا في الخلايا السرطانية 1 ويرتبط مع تطور و / أو ورم خبيث 2 ، 3 . اثنين من أشكال سيا الرئيسية في الثدييات هي Neu5Ac وشكل هيدروكسيلاتد، Neu5Gc 2 . البشر لا يمكن توليف Neu5Gc بسبب تعطيل معين من الجينات ترميز إنزيم سماه. هذا غير البشرية سيا يدمج الأيض في الخلايا البشرية باسم "النفس"، التي تنشأ من الأطعمة الغذائية NE5Gc الغنية (على سبيل المثال، واللحوم الحمراء) 4 ، 5 . Neu5Gc موجود في مستويات منخفضة على أسطح الخلايا من الظهارة البشرية و إندوثيليا، لكنه يتراكم خصوصا في سرطان. يتم التعرف على ne5Gc كما أجنبي من قبل الجهاز المناعي البشري الخلطية 2 ، 6 .قد تنشأ تعقيدات مستضد من Neu5Gc-غليكانز على مستويات متعددة، بما في ذلك تعديل Neu5Gc، الربط، غليكانز والسقالات الكامنة، وكثافتها، وكلها تنعكس من تعقيد استجابة الأجسام المضادة لمكافحة ne5Gc في البشر 6 . بعض هذه الأجسام المضادة بمثابة المؤشرات الحيوية سرطان و إمونوثيرابيوتيكش المحتملة 7 . وقد مهد ظهور توليف كيمونزيماتيك من سيالوغليكانز مختلفة 8 الطريق لمزيد من التحليل المتعمق لهذه الأجسام المضادة، ويسهلها استخدام تكنولوجيا ميكروأري غليكان 9 ، 10 . وهكذا، مع إعداد سهل والتلاعب من المكتبات الكبيرة من الكربوهيدرات الطبيعية والاصطناعية، أصبحت ميكروأرس غليكان قوية التكنولوجيا الإنتاجية العالية للتحقيق في التفاعلات من الكربوهيدرات مع عدد لا يحصى من الجزيئات الحيوية 10 ، 11 ، </sup> 12 ، 13 . في شكل صفيف، يتم استخدام كميات ضئيلة من المواد، وهذا العرض المتعدد من غليكانز ذات الصلة بيولوجيا يسمح للتحقيق في الآلاف من التفاعلات ملزمة في تجربة واحدة. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تطبق هذه التكنولوجيا على اكتشاف العلامات البيولوجية ورصد الاستجابات المناعية في عينات مختلفة 7 ، 12 .
ناجحة غليكان ميكروأري تلفيق يتطلب النظر في ثلاثة جوانب هامة: نوع روبوت الطابعة، غليكان الكيمياء اقتران، والبصريات الكشف. وفيما يتعلق بالنظر في صك الطباعة، هناك تقنيتان متاحتان: طابعات الاتصال وغير المتصلة. في الطباعة الاتصال، 1-48 دبابيس الصلب هي مغموسة في لوحة متعددة مصادر جيدا تحتوي على حل غليكان ويتم رصدها على الشرائح الزجاجية فونكتيوناليزد عن طريق الاتصال مباشرة على سطح الشريحة الزجاجية. كمية الحل دي ليفيد إلى الشريحة هي وظيفة من المدة العالقة على سطح الشريحة. عادة، يتم أولا رصد العينات على كتلة زجاجية (للوصول إلى بقع متجانسة) قبل طباعتها على سطح الشريحة. في طابعات عدم الاتصال (على سبيل المثال، الطابعة بيزو الإلكترونية)، يتم طباعة غليكانز من شعري زجاجي باستخدام الإشارات الكهربائية التي تسيطر عليها. يمكن معايرة إشارة كهربائية بدقة لتحقيق الطباعة أكثر دقة بالنسبة للطباعة الاتصال. حجم ومورفولوجية البقع هي أيضا أكثر تجانسا نسبيا. ميزة إضافية هي إعادة تدوير العينة مرة أخرى إلى لوحة المصدر بعد الطباعة. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي للطابعات بيزو الإلكترونية هو الحد طرف الطباعة (4 أو 8)، مما أدى إلى فترة طباعة طويلة جدا، الأمر الذي يتطلب اهتماما خاصا لاستقرار الشريحة ودرجة الحرارة والرطوبة، وتبخر العينة. طابعة نافثة للحبر غير الاتصال تتطلب كميات أكبر عينة 14 .
<p class = "jove_content"> على النقيض من محدودية الخيارات المتاحة لطرق الطباعة، الكيمياء غليكان اقتران هو النظر أكثر تعقيدا، مع العديد من الخيارات للاختيار من بينها. يجب أن تمثل الكيمياء تجميد مختارة لكل من المجموعات النشطة على غليكانز وتفاعل سطح الشريحة. غليكانز أن يجمد على سطح ميكروأري محددة، إما توليفها صناعيا أو معزولة بشكل طبيعي، وكلها تتطلب مجموعة رد الفعل متطابقة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن غليكانز تحتاج إلى أن تكون نقية ومتجانسة. من ناحية أخرى، يجب أن يوفر سطح تجميد والكيمياء استنساخ وكثافة مرفق موثوق بها. وقد تم تطوير أساليب تجميد متعددة مع التساهمية أو التساهمية (امتصاص المادية) مرفق 10 ، 11 ، 12 ، 13 . للحصول على معلومات مفصلة للغاية عن تكنولوجيا غليكان ميكروأري المطبوعة ل أونينياتيتد المحقق، الرجوع إلى هذه الاستعراضات الممتازة 13 ، 15 . الأهم من ذلك، الحد الأدنى من المعلومات المطلوبة لمبادرة تجربة غليكوميكس (ميراج) يصف المبادئ التوجيهية لإعداد العينات 16 والإبلاغ عن البيانات من تحليل ميكروأري غليكان 17 لتحسين المعايير في هذا المجال المتنامي.هنا، نحن تصف بروتوكول مفصل لتصنيع ميكروأرس سيالوغليكان باستخدام اتصال نانو طابعة محددة في شكل 16 جيدا. كل من غليكانز لديها أمين الأولية التي توسط ارتباط تساهمية إلى الشرائح الزجاجية المنشط الايبوكسي. نحن أيضا وصف تطوير وتحليل شريحة واحدة باستخدام مختلف عينات المصل البشري، الأجسام المضادة، و سيتين ملزم ليكتينس النبات. وتشمل المقايسات ميكروأري سيالوغليكان العديد من الخطوات الرئيسية التي تشمل تلفيق مجموعة والمعالجة والتنمية والتحليل. صفيف تلفيق يتطلب تخطيط أرتخطيط الشعاع، إعداد غليكانز و لوحة المصدر، برمجة نانو الطابعة، وطباعة الشرائح. وفي وقت لاحق، تتم معالجة الشرائح، وضعت، وتحليلها ( الشكل 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
نجاح التصنيع ميكروأري غليكان يتطلب تخطيط دقيق ويتضمن العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول. وتشمل هذه ما يلي: (1) تخطيط تخطيطات الفدرات واللوحة التي تحدد جميع المعلمات اللاحقة ( مثل المسافات والمباعدة بين العينات وكمية العينات والطباعة)؛ (2) تنظيف المسامير وضمان…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جائزة تطوير مهنة البحث من الصندوق الإسرائيلي لبحوث السرطان، وهي منحة من المبادرة الوطنية الإسرائيلية لتكنولوجيا النانو، وصندوق هيلمزلي الخيرية لمنطقة تقنية مركزية لأجهزة نانوميدينيس ل ثيرانوستيكش شخصية (ف-K)، و ناتيونال معاهد الصحة منحة R01GM076360 (إلى شك).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
