Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

atenção: um número de vírus da gripe circula na população humana (por exemplo, H1, H3) é patógenos de classe de nível 2 de biossegurança que devem ser manuseados com cuidado e equipamento de proteção pessoal apropriado. Manipulação de vírus deve ser aprovada pelo Conselho de revisão institucional. O seguinte protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional, no Monte Sinai. Nota: anticorpos específicos HA que inibem a replicação viral geralmente podem ser categorizados em i) que se ligam na ou adjacente do sítio de ligação do receptor no topo da cabeça globular e ii) que se ligam distal da ligação do receptor domínio, que inclui o lado lateral da cabeça globular e a região do caule do HA. Os anticorpos que o sítio de ligação do receptor-alvo evitar o engajamento dos motivos de ácido siálico na superfície das células alvo e podem ser medidos usando um ensaio de inibição (HI) de hemaglutinação. Anticorpos que são HI-negativas, tais como anticorpos específicos do caule, ainda pode inibir a replicação viral, mas só pode ser avaliado usando ensaios neutralização. 1. categorizando anticorpos baseado em actividades de neutralização e HI ensaio HI em uma placa de 96 poços V-fundo, adicione 25 µ l de PBS 1x nas colunas 2 a 12. Diluir o mAb 7B2 (cabeça-específico), 6F12 (específico do talo) 23 e um isotipo controle a 100 µ g/mL de 1X PBS e alíquota de 50 μL de preparações de anticorpo diluídos na coluna 1. Também não incluem um nenhum controle mAb pela adição de 50 µ l de PBS 1x ( figura 1A). Executar 2 vezes diluições em série dos anticorpos Transferindo 25 µ l de coluna 1 para coluna 2 e assim por diante. Descartar a última 25 µ l de coluna 12 ( figura 1A). Nota: Certifique-se de incluir uma linha de controle nenhum anticorpo. Diluir o estoque de vírus (vírus reassortant expressando o HA e de A/California/04/09 com os segmentos internos de A/Puerto Rico/8/34) para 8 hemaglutinação unidades/25 µ l diluída vírus circulante. Adicione 25 µ l do estoque de vírus diluído (8 hemaglutinação) a cada poço (linhas À G). Nota: A mistura de anticorpos e vírus deve ter um volume final de 50 µ l, com uma concentração inicial e final de 50 µ g/mL. Incubar a placa na temperatura de quarto (RT) de 45 min. Para a linha de volta-titulação (H), adicionar 50 µ l de PBS 1x em poços H2 a H12. Adicione 100 µ l da 8 hemaglutinação unidades/25 µ l para bem H1. Serialmente diluir dupla Transferindo 50 µ l de H1 para H2 e assim por diante. Descarte as últimas 50 µ l de H12 bem. Finalmente, adicionar 50 µ l de galinha 0,5% glóbulos vermelhos (RBC) para todas as cavidades da placa de 96 poços V-fundo. Nota: As amostras de mAb no ensaio devem ter um volume final de 100 µ l: mAb (25 µ l), vírus (25 µ l) e RBC (50 µ l). O volume final do mAb sem controle deve conter 25 µ l de 1X PBS, 25 µ l de vírus e 50 µ l de RBC. Incubar a placa a 4 ° C, durante 1 h. Visualmente ler as placas para a atividade de HI. Se houver uma leitura positiva para um anticorpo específico, vá para a etapa 2.1 para gerar variantes de fuga. Se o anticorpo é HI-negativo, proceda abaixo a etapa 1.2 para avaliar se o anticorpo tem que neutralizar a atividade em um ensaio de cultura de células. Nota: Uma leitura positiva de um mAb HI-ativo é indicada por uma pelota de RBC vermelha escura no centro de um poço ( figura 1B 7B2) que formarão uma lágrima quando a placa de 96 poços de V-fundo é mantida em um ângulo de 45 °. Uma leitura negativa não formará uma pelota de RBC vermelha escura no poço ( figura 1B 6F12 e nenhum mAb). O isotipo controle também não formará uma pelota de RBC vermelha escura e deve olhar idêntico para o anticorpo específico de caule, 6F12 ou o mAb não controlar a amostra ( figura 1B) 23. Microneutralization ensaio placa Madin Darby Canine renal (MDCK) células em uma densidade de 2 x 10 4 células/poço em cultura de tecido Tratado placa de 96 poços e incubar a 37 ° C e 5% CO 2 para 17 a 19 h . Nota: As células também podem ser autorizadas a aderir ao fundo do poço para um mínimo de 4 h antes do uso. Em uma placa de 96 poços separada, realizar sete 3 vezes diluições em série do mAb humana 4D 05 5, CR9114 17 isotipo IgG controle ou, em uma concentração inicial de 200 µ g/mL em 1 X meio essencial mínimo (MEM) suplementado com Tosil fenilalanil clorometil cetona (TPCK)-Tratado de tripsina (1 µ g/mL) ( Figura 2). Nota: A linha A deve conter 75 µ l de anticorpo diluído (começando a concentração de 200 µ g/mL). Serialmente diluir (3 vezes) abaixo da placa de transferência de 25 µ l de linha A linha b e assim por diante. Linhas de À H, devem ter um volume final de 50 µ l. Não há nenhuma necessidade de mudar dicas entre as transferências de diluição. Diluir o estoque de vírus (vírus reassortant expressando a HA e o at de A/Shanghai/1/13 com o segmento interno de A/Puerto Rico/8/34) para um 100 de cultura de tecido 50% dose infecciosa (TCID 50) / 50 µ l em 1 x MEM suplementado com TPCK-tratada tripsina (1 µ g/mL) 24. Adicione 50 µ l/poço de vírus diluído para os preparativos de anticorpo (etapa 1.2.2). Adicionar 50 µ l de 1 X MEM nos poços de controle de células não infectadas. Incubar as misturas vírus-anticorpo em uma incubadora de 37 ° C (com 5% CO 2) para 1 h. Nota: As misturas de vírus-anticorpo devem ter um volume total de 100 µ l: 50 µ l da diluição de anticorpo (etapa 1.1.2) e 50 µ l de vírus contendo 100 TCID 50 (etapa 1.2.3). Aspire a mídia nos poços e adicionar o inteiro 100 µ l de misturas de vírus-anticorpo correspondentes poços. Nota: A aspiração é feita usar um adaptador de 8 canais aspirador ligado a um vácuo. Alternativamente, uma micropipeta multicanal 8 – ou 12-bem pode ser usada para aspirar manualmente. Toda aspiração durante a remoção do inóculo ou lavagens é feita a partir da maior concentração de anticorpo para o mais baixo, sem a necessidade de trocar dicas. Lavar a monocamada com 200 µ l de 1X PBS. Aspire a 200 µ l de PBS 1x (como na etapa 1.2.5). Repita a lavagem mais uma vez, para um total de duas lavagens. Infectar a monocamada de células MDCK adicionando toda 100 µ l/poço de misturas de vírus-anticorpo (da etapa 1.2.4) na monocamada e infectar/incubar a 37 ° C (com 5% CO 2) para 1 h. Durante a infecção, em um prato separado de 96 poços, preparar um outro conjunto de diluições de anticorpo. Adicionar 150 µ l de 100 µ g/mL do respectivo anticorpo na linha A e 100 µ l de 1 x MEM suplementado com tripsina TPCK-tratada (1 µ g/mL) em linhas B de H. realizar 3 vezes diluições Transferindo 50 µ l de linha A linha b , e assim por diante, até a linha H. descarte as últimas 50 µ l de H. linha O volume total para cada bem deve ser igual 100 µ l. Reserve. Nota: Os anticorpos são diluídos em 1 x MEM suplementado com tripsina TPCK-tratada (1 µ g/mL). Aspire o inóculo de vírus-anticorpo da monocamada na etapa 1.2.7 e reabastecer com o inteiro 100 µ l/poço da diluição apropriada anticorpo preparado na etapa 1.2.8. Nota: Se um bem contido uma concentração final de anticorpo de 100 µ g/mL durante a infecção (etapa 1.2.7) e, em seguida, a abastecimento de mídia também deve conter uma concentração de anticorpo final de 100 µ g/mL (passo 1.2.8). Incubar por 24 h em uma incubadora de 37 ° C (com 5% CO 2). Os meios das placas de 96 poços de aspirar e lavar com 200 µ l/poço de 1X PBS três vezes. Consertar as células com 100 µ l de acetona gelada de 80% para 1 h, a -20 ° C. Nota: A solução de acetona 80% é diluída em água destilada dobro (dd) H 2 O (por exemplo, 80 mL de acetona 100% mais 20 mL de DDQ 2 0). A solução de acetona 80% pode ser refrigerada no gelo antes do uso. Lavar as células com 200 µ l/poço de 1X PBS três vezes. Bloco as placas com 200 µ l/poço de leite 5% diluído em 1X PBS e incubam as placas em RT para 1 h. Adicione 100 µ l de biotinilado antigripe um anticorpo primário da cadeia (NP) diluído 1:2,000 1 x PBS/1% albumina de soro bovino (BSA) e incubar as placas em RT para 1 h. Nota: Para o vírus da gripe B, um anticorpo de anti-NP gripe B vírus específico deve ser usado. Lavar as placas com PBS 1x três vezes. Adicione 100 µ l de rabanete de cavalo-estreptavidina peroxidase (HRP) conjugado anticorpo diluído 1:3,000 1 x PBS/1% BSA e incubar as placas em RT para 1 h. Lavar os pratos com 200 µ l de PBS 1x três vezes. Adicionar o reagente substrato HRP em 100 µ l/poço e incubar no escuro no RT. Nota: O tempo de incubação deve ser otimizado antes da adição do ácido parar buffer (abaixo). De um modo geral, 15 a 30 min é suficiente. Saciar a reação com 50 µ l/poço de 5 M de HCl. Cuidado: 5M HCl é um reagente altamente corrosivo que pode causar danos aos olhos, pele e membranas mucosas. Adição deste reagente deve ser feita sob um capuz ventilado com equipamento de proteção pessoal apropriado. Ler as placas em 492 nm e subtrair os poços de fundo (células não infectadas). Calcular a percentagem de inibição com a seguinte fórmula: se um anticorpo tem atividade neutralização (e nenhuma atividade HI), avance para o passo 2.2. Nota: Os anticorpos que faltam em vitro atividade de neutralização faltará atividade HI. 2. Geração de variantes de mutante de Escape Nota: anticorpos neutralizantes ou faltam de atividade HI analisam-se ainda mais com os protocolos específicos descritos abaixo. Protocolo 1: anticorpos HI-positivo/neutralização-positivo ( Figura 3A ) preparar um estoque de vírus de 10 6 placa formando unidades/mililitro (PFU/mL) em PBS 1x em um volume de 400 µ l. Preparar quatro diluições do anticorpo de interesse em concentrações crescentes (por exemplo, 0, 0,5, 0,05 e 0,005 mg/mL) em PBS 1x, em um volume de 100 µ l por diluição. Nota: O vírus selvagem-tipo sempre devem ser passado em paralelo e na ausência de anticorpo. As sequências desses vírus passaged ajudará a distinguir entre a adaptação às condições de cultura de células e escapar de mutações. Mix 100 µ l de 10 6 PFU/mL de vírus com 100 µ l de cada diluição de anticorpo ou 100 µ l de PBS 1x. Incubar por 1h em uma incubadora de 37 ° C (com 5% CO 2). Vórtice brevemente. Injetar 200 µ l de cada mistura de ovos de galinha do patógeno específico livre (SPF) embrionados. Incubar os ovos a 37 ° C (sem CO 2) para 40-44 h. Sacrificar os ovos embrionados infectado de vírus incubando a 4 ° C por um período mínimo de 6 h. Colher o líquido alantoico dos ovos, como descrito anteriormente 24 , 25. Realizar o ensaio de hemaglutinação, conforme descrito acima de 24 , 26. Se todos os preparativos de líquido alantoico não têm títulos de hemaglutinação, repita da etapa 2 com diluições de anticorpo, variando de 0,005 mg/mL de 0,00005 mg/mL. Nota: Uma concentração de impregnação de um anticorpo HI-positivo pode neutralizar todas as partículas de vírus presentes. Portanto, pode ser necessário diminuir a quantidade de anticorpo presente na passagem. Confirmar as variantes de fuga, realizando o HI ensaio 24 (etapa 1.1). Nota: Os anticorpos HI-ativo bloqueiam HA noivado de ácido siálico motivos nas células alvo. Portanto, um vírus na presença de seu anticorpo cognato perde a capacidade de aglutinar hemácias (presença de sedimento RBC). Teoricamente, variantes de fuga de anticorpos HI-ativo podem ainda ligar motivos de ácido siálico, mesmo na presença de seu anticorpo cognato e assim podem aglutinar hemácias (pellet não RBC). Se a HI do anticorpo de interesse é ainda detectável, repetir o protocolo da etapa 2.1.2 com uma maior concentração inicial do anticorpo. 2 do protocolo: anticorpos HI-negativo/neutralização-positivo ( Figura 3B ) Nota: a fim de gerar variantes de fuga que falta HI anticorpos neutralizantes contra o atividade, o vírus deve ser passado na presença de quantidade crescente de anticorpo. Células MDCK placa em uma placa de 6 em uma densidade de 1 x 10 6 células/poço e incubar durante um mínimo de 4 h em uma incubadora de 37 ° C (com 5% CO 2). Diluir o estoque de vírus para 10 6 PFU/mL ou o vírus da passagem anterior em 1 x MEM com tripsina TPCK-tratada (1 µ g/mL) em um volume de 500 µ l. Preparar uma diluição única de anticorpo (0,02 mg/mL para a passagem original ou superior para todos após passagens) em 1 x MEM com tripsina tratada com TPCK em um volume de 250 µ l. Mix 250 µ l de vírus diluído com 250 µ l de anticorpo diluído (+ anticorpo) ou 250 µ l de 1 x MEM (sem controle de anticorpo). Incubar a mistura de vírus-anticorpo por 30 min em uma incubadora de 37 ° C (com 5% CO 2). Aspirado a mídia usando um vidro Pasteur pipeta e lave a monocamada de células com 1 mL de 1X PBS. Adicionar 500 µ l da mistura nos poços e incubá-los numa incubadora 37 ° C (com 5% CO 2) para 1 h. Depois da 1h, completar os poços com 2 mL de 1 x MEM com tripsina TPCK-tratada (1 µ g/mL). Verificar as células a pós-infecção 48 h para sinais de efeito citopático (ECP) no microscópio ou realizar um ensaio de hemaglutinação para detectar o crescimento viral 26. Se houver CPE de bruto nas culturas suplementadas com anticorpo, colher o sobrenadante em múltiplos cryo-tubos, etiqueta com o número da passagem e loja a -80 ° C. Salvar 100 µ l do sobrenadante para infectar um monolayer fresco de MDCKs com 2 mL de 1x MEM suplementado com TPCK-tripsina e anticorpo. Lembre-se de não incluir um controle de nenhum anticorpo para cada passagem. Nota: Aumente a concentração do anticorpo por duas vezes (ou a critério do pesquisador) na passagem seguinte (a cada dois dias). Aumentar a concentração do anticorpo em cada passagem sucessiva até o crescimento de vírus ainda é viável, mesmo com uma concentração final de 0,6 mg/mL de anticorpo. Congelar os vários frascos de sobrenadante de cada passagem e armazenam a -80 ° C. Nota: O controle de nenhum anticorpo é crucial para verificar se o crescimento do vírus de uma passagem para outro. Se houver CPE de bruto no controle nenhum anticorpo, mas nenhum CPE na + grupo de anticorpos, isso indica que a concentração do anticorpo foi muito alta e não há variantes de fuga foram geradas. Se houver bruta CPE no controle nenhum anticorpo, mas apenas moderar o CPE na + grupo de anticorpos, isto indica a presença de possíveis variantes de fuga. Na próxima passagem, aumentar o volume de passagem a 200 µ l do sobrenadante e manter a concentração de anticorpo para aumentar a probabilidade de gerar variantes fuga. 3. Isolamento de variantes escapar através da purificação de placa células MDCK placa em uma placa de 6 em uma densidade de 1 x 10 6 células/poço e incubar durante um mínimo de 4 h em uma incubadora de 37 ° C (com 5% CO 2). Diluir os anticorpos em 1 x MEM com tripsina tratada TPCK começando com 300 µ g/mL em um volume de 250 µ l e misture com 250 µ l de vírus mutante de fuga correspondente. Vírus passadas na ausência de anticorpo também devem ser purificada de placa. Aspire os meios de comunicação das células, lavar com PBS 1x três vezes e adicionar o inteiro 500 µ l de mistura de vírus-anticorpo (passo 3.2). Incubar as placas por 1h em uma incubadora de 37 ° C (com 5% CO 2) certificando-se de rock e para trás cada 10min para evitar a secagem da monocamada. Aspire as misturas de vírus-anticorpo e reabastecer os poços com media de sobreposição ágar contendo quantidades correspondentes de anticorpo (300 µ g/mL; passo 3.2). Incubar a placa para 40-44 h numa incubadora 37 ° C (com 5% CO 2). As placas visíveis do círculo com um marcador de cor azul ou preta para facilitar a colheita placa. Escolher quatro placas para cada escape combinação de vírus-anticorpo mutante, bem como vírus selvagem-tipo que foram passado em células MDCK ou ovos na ausência de anticorpo. Resuspenda a placa em 100 µ l de PBS 1x. Injetar o inteiro 100 µ l de vírus mutante de fuga purificado de placa em 10 dias de idade ovos de galinha embrionados SPF. Incubar os ovos para 40-44 h numa incubadora 37 ° C (sem 5% CO 2). Realizar um ensaio de hemaglutinação para confirmar a presença do vírus (etapa 1.1). 4. Extração de RNA Viral e variação de sequência análise de HA do RNA viral extraído de 200 µ l de líquido alantoico de vírus mutante de fuga com uma mono-fásicos solução de fenol e guanidina isotiocianato. Atenção: O fenol é um reagente líquido volátil que pode causar tosse, falta de ar e irritam moderadamente a pele por contato. Amplificar o segmento HA partir do RNA viral com o uso de um transcriptase reversa e primeiras demão gene-específico para a gripe A HA segmento 27. Nota: Os primers universais para vírus de influenza B descritos no quadro 2 amplificam tanto o HA (~ 1.800 bp) e o at (~ 1.500 bp) 28. Resolver o produto de RT-PCR em um gel de agarose a 1% e cortar a banda corretamente tamanho (~ 1.800 bp). Gel extrato o produto do PCR usando um procedimento de purificação de sílica-membrana com base e mandar o cDNA para sequenciamento. Identificar o resíduo de aminoácido necessário para ligação de anticorpos por diferenciar as mutações encontradas em variantes putativo fuga e passadas vírus tipo selvagem devido a adaptação de cultura celular ou seleção imunológica. Clone do produto PCR que contém o selvagem-tipo ou variante HA de fugir em um vetor de expressão pCAGGs (NotI e NheI). Ligação do anticorpo para a variante de fuga HA pode ser avaliada com uma das duas opções (ou ambos) descrito abaixo. 5. Anticorpo ligação análises de escapar as variantes imunofluorescência placa 293T células em uma densidade de 2 x 10 4 células/poço em uma placa de 96 poços e incubar na incubadora (com 5% CO 2) 37 ° C por 24 h. Transfect as células com 0,10 µ g/poço dos pCAGGS plasmídeos codificação o mutante de fuga HA, vírus passadas HA e HA de tipo selvagem (unpassaged) com a utilização de um reagente de transfeccao. Incubar as placas de 96 poços para 48 h incubadora de 37 ° C (com 5% CO 2). Fix com 100 µ l de paraformaldeído 0,5% por 15 min no RT. Cuidado: Paraformaldehyde é um reagente líquido volátil que pode causar tosse, falta de ar e irritam moderadamente a pele por contato. Ele foi designado como um potencial carcinogênico humano. A adição do reagente deve ser feita em uma capa de química exalada. Lavagem com PBS 1 x 3 vezes. Bloco com 5% de leite em PBS 1x por 1h no RT. Lavagem com PBS 1x três vezes. Incube com 5 µ g/mL de anticorpo de interesse por 1h no RT. Incubar com 100 µ l de anticorpo secundário (anti-humano ou anti-rato Alexa 488), a uma diluição de 1:2,000 em 1 x BSA PBS/1% por 1h no RT no escuro. Lavagem com PBS 1x três vezes. Observar as células em um microscópio fluorescente para coloração positiva ou negativa. Classificação de célula fluorescência-ativado (FACS) células/poço em uma placa de 6 células de 293T placa em uma densidade de 2 x 10 5 e incubam a 37 ° C (com 5% CO 2) por 24 h. Transfect as células com 0,50 µ g/poço com pCAGGS plasmídeos codificação o mutante de fuga HA, vírus só passadas HA e HA de tipo selvagem com a utilização de um reagente de transfeccao. Incubar as placas 6-poços por 48 h a 37 ° C (com 5% CO 2). Após 48 h, aspirar a mídia de crescimento e lavagem com PBS 1x duas vezes suavemente (certificando-se que a monocamada permanece inalterada). Colher as células transfectadas 293T com 500 µ l de tampão de FACS (1 x PBS/2% soro de vitela fetal). Nota: FACS buffer deve ser previamente refrigerado a 4 ° c antes do uso. Centrifugar as células colhidos 293T a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Aspirar o buffer de FACS e ressuspender com 200 µ l de tampão de FACS contendo mAbs de interesse (concentração final de 1 a 5 µ g/mL). Incubar a RT por 20 min. Centrifugar as células a 300 x g durante 5 min à 4 ° C. Lave duas vezes com 500 µ l de tampão de FACS. Aspire cuidadosamente com um vidro de pipeta Pasteur para não perturbar o sedimento. Resuspenda com 200 µ l de tampão de FACS contendo anticorpo secundário conjugado com Alexa 488 (diluição final de 1:1, 000). Incubar no escuro a 4 ° C por 20 min. Centrifugar as células em 300 g por 5 min em 4 ° C. Lave duas vezes com 500 µ l de tampão de FACS e Aspire cuidadosamente com o tampão de lavagem. Resuspenda em 500 µ l de tampão de FACS e avaliar a vinculação de Celia, e/ou policlonais soros para células transfectadas com HA por FACS. Nota: Lembre-se de incluir um nenhum controle de soros policlonais/mAb, bem como uma amostra de untransfected no experimento.