エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代

注意: 人間の人口 (例えば H1、H3) のインフルエンザ ウイルスの数はバイオ セーフティ レベル 2 クラス病原体ケアと適切な個人用保護具を処理する必要があります。ウイルスの処理は、制度検討委員会によって承認されなければなりません。次のプロトコルは、シナイ山で制度上の審査委員会によって承認されました。 注: ウイルスの複製を阻害する HA 特異抗体は上または球状の頭の上に受容体結合部位の隣接するバインド i) 物と受容体結合の遠位バインド ii) もの一般的に分類できますドメインは、球状の頭部側面と HA の茎地域が含まれています。受容体結合部位を対象とする抗体は、標的細胞の表面のシアル酸のモチーフの婚約を防ぎ、赤血球凝集抑制 (HI) 試験を使用して測定することができます。HI 陰性、抗体、茎特有の抗体などまだウイルスの複製を抑制することができますが、中和の試金を使用してのみ評価できます。 1 抗体は HI と中和の活動に基づく分類 こんにちはアッセイ 96 ウェル V 底プレートで列 2 に 12 で 1 × PBS の 25 μ l を追加します。。 では、mAb 7B2 (頭固有)、6F12 (茎固有) 23 および 100 μ g/ml x PBS と列 1 に希釈した抗体製剤の 50 μ L 分注 1 にアイソタイプ コントロールを薄くしなさい。1 × PBS ( 図 1 a) の 50 μ L を追加することによってコントロールなしの mAb があります。 列 2、列 1 から 25 μ L を移すことによって抗体の 2 倍のシリアル希薄を実行など。( 図 1 a) 12 の列から最後 25 μ L を破棄します 。 注: 抗体・ コントロールなしの行を含めることを確認します。 は、8 凝集ユニット/25 μ L 希釈ウイルス ストックするウイルス株 (内部セグメントの A/Puerto リコ/8/34 HA と NA の A/カリフォルニア/04/09 を表現するリアソータント ウイルス) を希釈します。(行 A g) 各ウェルに希釈ウイルス株 (8 凝集) の 25 μ L を追加します 。 メモ: 抗体とウイルスの混合物が必要 50 μ G/ml の開始最終濃度を 50 μ L の最終巻。 加温室温 (RT) 45 分でプレート 滴定行 (H) には、50 μ L の 1 × PBS を H2 の井戸で H12 に追加。H1 をうまく 8 凝集ユニット/25 μ L の 100 μ L を追加します。連続 H2、H1 から 50 μ L を移すことによって 2 倍を希釈しなど。よく H12 から最後の 50 μ L を破棄します。最後に、96 ウェル V 底板のすべてのウェルに 0.5% ニワトリ赤血球 (RBC) の 50 μ L を追加します 。 注: アッセイの mAb サンプルでは 100 μ L の最終巻を持っている: mAb (25 μ L)、ウイルス (25 μ L)、赤血球 (50 μ L)。制御なしの mAb の最終巻は 25 μ L の PBS x 1、ウイルスを 25 μ l 添加し、赤血球の 50 μ L を含める必要があります。 加温 1 のための 4 ° C でプレート は視覚的に、こんにちはアクティビティの板をお読みください。ある特定の抗体のための肯定的な読み出しと、2.1 エスケープのバリエーションを生成するためのステップに進んでください。抗体がこんにちは負の場合は、抗体は細胞培養の試金活動を中和できれば評価 1.2 をステップへ進みます下 。 注: こんにちはアクティブ mAb の肯定的な読み出しは、96 ウェル V 底板は 45 ° の角度で開催されたときにティア ドロップを形成する ( 図 1 b 7B2) 井戸の中心部に暗い赤い赤血球ペレットによって示されます。負の値の読み出しがよく ( 図 1 b 6F12 とない mAb) 暗い赤い赤血球ペレットを形成しません。アイソタイプ コントロールがない暗い赤い赤血球ペレットを形成しても、茎特異抗体、6F12 またはない mAb と同一に見る制御サンプル ( 図 1 b) 23. と中和試験 プレート マディン ダービー犬腎臓 (MDCK) 細胞組織培養の細胞/ウェル 2 × 10 4 の密度で 96 ウェル プレートを扱われ、17、19 h の CO 2 を 37 ° C、5% で孵化させなさい。 注: 使用する前に 4 h 以上の井戸の底に付着するセルを許可もできます。 7 を実行別の 96 ウェル プレートで 4 D の人間の mAb の 3 倍のシリアル希薄 05 の 5、開始濃度 200 μ g/mL の X の最小必須培地 (MEM) 1 トシル基を添加した CR9114 17 またはアイソタイプ IgG コントロールphenylalanyl クロロメチル ケトン (TPCK)-トリプシン (1 μ g/mL) を扱われます ( 図 2). 注: 行 A (200 μ G/ml の濃度を開始)、希釈の 75 μ L を含める必要があります。連続 25 μ L を A 行から B 行に転送することによって、プレートを希釈する (3 倍) など。H 行 A 50 μ L の最終巻が必要です。希釈転送間にヒントを変更する必要はありません。 50% 組織培養感染量 (TCID 50) の 100 のウイルス株 (リアソータント ウイルス HA および NA の/上海/1/13 A/Puerto リコ/8/34 の内部セグメントを表現する) の希釈 1 x 50 μ L MEM TPCK 治療を補完/トリプシン (1 μ g/mL) 24。抗体製剤 (ステップ 1.2.2) に希釈ウイルスの 50 μ L/ウェルを追加します。感染していない細胞制御の井戸に 1 X MEM の 50 μ L を追加します。 インキュベート (5% CO 2) と 1 のための 37 ° C インキュベーターでウイルス抗体の混合物 注: ウイルス抗体の混合物では 100 μ L の容量を持っている: 抗体希釈 (ステップ 1.1.2) の 50 μ L と 100 TCID 50 (ステップ 1.2.3) を含むウイルスの 50 μ L. 吸引井戸にメディアと対応する井戸にウイルス抗体の混合物の全体の 100 μ L を追加します 。 注: 吸引を行う 8 ch 吸引アダプターを使用して真空に接続されています。また、手動で吸引する 8 または 12 もマルチ チャンネル マイクロ ピペットを使用可能性があります。変更する必要があるなし菌除去または洗浄液の中にすべての吸引が最低の値、抗体の最高濃度から行われます。 1x PBS の 200 μ L で単分子膜を洗います。(1.2.5 のステップ) のように 1 × PBS の 200 μ L を吸い出しなさい。合計 2 回洗濯洗濯物をもう一度繰り返す。 感染全体 100 μ L/ウェルの単分子膜と感染/, 1 のため (5% CO 2) と 37 ° C で (ステップ 1.2.4) からウイルス抗体の混合物を追加することによって MDCK 細胞の単層 別の 96 ウェル プレートで、感染時に抗体の希薄の別のセットを準備します。150 μ L を追加行でそれぞれ抗体の 100 μ g/mL と 1 つの x の 100 μ L の MEM TPCK 扱われるトリプシン (1 μ g/mL) H. 実行行 B で 3 倍希釈によって補完 A 行から B 行に 50 μ L を転送します。、行 h. 破棄行 H から最後 50 μ L まで、などと各容量も 100 でなければ μ おきます。 。 注: 抗体は 1 x TPCK 扱われるトリプシン (1 μ g/mL) を添加した MEM で希釈されています。 1.2.7 のステップで単分子膜からウイルス抗体菌を吸引し、全体 100 μ L/ウェル 1.2.8 準備した適切な抗体の希釈と補充します 。 注: 場合も含まれています。感染症 (ステップ 1.2.7)、補給のメディアの中に 100 μ g/mL の最終的な抗体濃度が 100 μ g/mL (ステップ 1.2.8) の最終的な抗体濃度を含める必要があります。 (5% CO 2) と 37 ° C のインキュベーターで 24 h 間加温します。 96 ウェルのプレートからメディアを吸引し、3 回 200 μ L/ウェルの 1x PBS で洗浄します。 -20、1 時間冷 80% アセトンの 100 μ L のセルを修復する ° C 注: 80% アセトン溶液は二重蒸留 (dd) H 2 O (例えば 100% アセトン 80 mL プラス ddH 2 0 20 mL) で希釈しました。80% アセトン溶液は使用する前に氷の上冷蔵できます。 1x PBS の 200 μ L/ウェルの細胞を 3 回洗浄します。 ブロックで 5% の牛乳の 200 μ L/ウェル プレート 1x PBS で希釈、1 h. のための RT でプレートを孵化させなさい ビオチン化抗インフルエンザ ウイルス核タンパク質 (NP) の一次抗体の追加 100 μ L 1 PBS/1% ウシ血清アルブミン (BSA) x 1:2,000 を希釈し、1 のための RT でプレートを孵化させなさい 注: B 型インフルエンザ ウイルス、B 型インフルエンザ ウイルス特異抗 NP 抗体使わなければなりません。 1x PBS でプレートを 3 回洗浄します。 ストレプトアビジン – わさびペルオキシダーゼ (HRP) 共役抗体の追加 100 μ L 1 PBS/1% BSA x 1:3,000 を希釈し、1 h. のための RT で版を孵化させなさい プレート 1 × PBS の 200 μ L で 3 回の洗浄です。 HRP 基質試薬を 100 μ L/ウェルで追加し、暗い室温で孵化させなさい 注: 酸性停止バッファー (下記参照) の追加の前にインキュベーション時間を最適化する必要があります。一般的に言えば、15 〜 30 分は十分です。 5 M HCl の 50 μ L/ウェルとの反応を抑制します 。 注意: 5 M HCl は、目、皮膚、粘膜に損傷を引き起こすことができる腐食性の高い試薬です。この試薬の付加は適切な個人用保護具と出されたフードの下で行う必要があります。 492 でプレートを読む nm と背景 (感染細胞) 井戸を減算します。 は次の式で割合抑制を計算: 場合は抗体があり、中和活動 (こんにちはアクティビティがない)、2.2 の手順に進みます 。 注: 不足中和活性 の in vitro 抗体が不足こんにちは活動。 2。エスケープ変異亜種の世代 注: 中和抗体またはこんにちは活動がないさらに以下で説明する特定のプロトコルを分析します。 プロトコル 1: こんにちは/肯定中和抗体 ( 図 3A ) 10 のウイルス ストックの準備 6 プラークの 1x PBS でユニット/ミリリットル (PFU/mL) を形成400 μ L のボリューム。 準備 4 希釈濃度を高めることに関心の抗体の (例えば 0、0.5、0.05、0.005 mg/mL) 希釈あたり 100 μ L のボリュームの 1x PBS で 。 注: この野生型ウイルスは並列で、抗体がない場合に常に継代します。これらの継代ウイルスのシーケンスは細胞の培養条件と変異を脱出への適応間の区別に役立ちます。 ミックス 100 μ L の 10 6 Pfu/ml 各抗体希釈の 100 μ L または 1 × pbs 100 μ L にウイルス。 (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 1 時間加温。渦は簡潔に。各混合物の 200 μ L を注入特定病原体無料 (SPF) 鶏鶏卵。 37 ° C (CO 2) なし 40 44 h. で卵を孵化 6 h 以上の 4 ° C で培養によるウイルス感染包蔵卵を犠牲に 上記 24 , 25 卵から尿液を収穫します。 は、 24 , 26 を上記のように赤血球凝集アッセイを実行します。赤血球凝集価がない尿液体調製物のすべては、0.00005 ミリグラム/ml 0.005 mg/mL に至る抗体希釈で手順 2 から繰り返します 。 注: こんにちは陽性抗体の飽和濃度が存在するすべてのウイルス粒子を中和します。したがって、抗体、継の現在の量を削減する必要があります。 HI を実行することによってエスケープ亜種アッセイ 24 (ステップ 1.1) を確認します 。 注: アクティブ HI 抗体は、標的細胞上のシアル酸モチーフの HA 婚約をブロックします。したがって、その同種抗体の存在下でウイルスは赤血球 (RBC ペレットの存在) を凝集能力を失います。理論的には、HI 活性抗体のエスケープ バリエーション、その同種抗体の存在下でもシアル酸モチーフをバインドすることもおよびこうして赤血球 (RBC ペレットなし) を凝集することができます。興味の抗体の HI が依然として検出の場合抗体の開始濃度の増加とともにステップ 2.1.2 からプロトコルを繰り返します。 プロトコル 2: こんにちは/ネガポジ中和抗体 ( 図 3B ) 注: 中和不足 HI 抗体に対してエスケープのバリエーションを生成するために活動、ウイルスは、増加する抗体の量の存在下で継代する必要があります。 密度 1 × 10 6 6 ウェル プレートにプレート MDCK 細胞細胞/ウェルと (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 4 時間以上インキュベートします。 希釈 10 ウイルス ストック 6 PFU/mL または 1 の前の通路からウイルス x TPCK 扱われるトリプシン (1 μ g/mL) 500 μ L のボリュームで MEM。 抗体 (0.02 mg/mL のオリジナルの通路またはすべての次の通路の高い) 1 の単一希釈を準備 x 250 μ L のボリュームで TPCK 扱われるトリプシン MEM。 ミックス 250 μ L 希釈抗体 (+ 抗体) の 250 μ L で希釈ウイルスまたは 1 の 250 μ L の MEM (抗体コントロールなし) x. ウイルス抗体の混合物 (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 30 分間インキュベートします。 吸引ガラス パスツールを使用してメディアのピペット、1 ml の 1x PBS のセルの単一層を洗うです。 井戸に混合物を 500 μ l 添加し、(5% CO 2) と 1 のための 37 ° C インキュベーターで孵化させなさい 1 h 後補足 1 の 2 mL で井戸 MEM TPCK 扱われるトリプシン (1 μ g/mL) x. 標識の顕微鏡で細胞変性効果 (CPE) の感染を後 48 時間で細胞を確認するか、ウイルス増殖 26 を検出する赤血球凝集アッセイを実行します。 抗体を添加した培養における総 CPE がある場合は、通路番号-80 で店と複数のクライオ チューブ、ラベルの上澄みを収穫 ° C 2 ml の 1 x の MDCKs の新鮮な単分子膜に感染する上清の 保存 100 μ L MEM TPCK トリプシンと抗体を補った。すべての通路のない抗体コントロールを含めるようにしてください 。 注: は次の文章 (2 日間) で、抗体の濃度を 2 倍 (または研究者の裁量で) で増加します。 のウイルス増殖が 0.6 mg/mL の抗体の最終濃度がも実行可能になるまで各連続通過の抗体の濃度を増やします。それぞれの上清の複数のバイアル通路し、-80 で保存凍結 ° C 注: コントロールなしの抗体は別に 1 つの通路からウイルスの増殖を確認する重要です。ないの抗体の管理で総 CPE もない CPE の場合、+ 抗体グループ、これは抗体の濃度が高すぎるとエスケープの亜種は生成されませんでしたを示します。ある場合ないの抗体コントロールに CPE を総が、唯一の CPE の適量、+ 抗体グループ、潜在的なエスケープの亜種の存在を示します。次の通路で音量上清 200 μ L を通路とエスケープの亜種を生成する可能性を高めるための抗体の濃度を維持します。 3。プラーク精製のバリエーションを介してエスケープの分離 密度 1 × 10 6 6 ウェル プレートにプレート MDCK 細胞細胞/ウェルと (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 4 時間以上インキュベートします。 希釈 1 抗体 300 μ g/mL 対応するエスケープ変異ウイルスの 250 μ L で 250 μ L とミックスのボリュームで始まる TPCK 扱われるトリプシン MEM x。抗体のない状態で継代ウイルスにはプラーク精製する必要があります。 細胞からメディアを吸引、3 回 1x PBS で洗浄、ウイルス抗体の混合物 (ステップ 3.2) の全体の 500 μ L を追加します。 プレート ロック前後、単分子膜の乾燥を防ぐために 10 分ごとに確かめる (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 1 時間インキュベートします。 ウイルス抗体の混合物を吸引し、オーバーレイ寒天メディア対応する抗体 (300 μ G/ml; ステップ 3.2) 量を含むと井戸を補充します。 (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 40-44 時間プレートをインキュベートします。 サークル表示プラーク プラーク ピッキングを容易にする青または黒色マーカーと。 ピック 4 斑ごと脱出 MDCK 細胞や抗体の不在で卵で継代した野生型ウイルスと同様に、変異ウイルス抗体の組み合わせ。 100 μ L の 1x PBS でプラークを再懸濁します。 10 日間の古い SPF 鶏鶏卵プラーク精製エスケープ変異ウイルスの全体の 100 μ L 注入します。 (なし 5% CO 2) 37 ° C の定温器で 40-44 時間卵を孵化します。 赤血球凝集アッセイ (ステップ 1.1) のウイルスの存在を確認するを実行します。 4。ウイルス RNA と HA の解析シーケンス変化の抽出 200 からウイルスの RNA の抽出 μ L エスケープ変異ウイルス尿液フェノールとグアニジン イソチオシアネートのモノラル一過性ソリューションです 。 注意: フェノールは咳、息切れが発生し、適度の接触によって皮膚を刺激する揮発性の液体試薬。 は、ウイルスの逆転写酵素を使って RNA から HA セグメントを増幅してインフルエンザの HA 遺伝子特定のプライマー セグメント 27 。 注: B 型インフルエンザ ウイルスについて、表 2 のための普遍的なプライマー増幅両方 HA (~ 1,800 bp) na (〜 1,500 bp) 28. 1% アガロースゲルの RT-PCR の製品を解決し、正しいサイズのバンドをカット (~ 1,800 bp). シリカ膜による浄化プロシージャを使用して PCR の製品のゲルの抽出とシーケンスの cDNA を出す。 突然変異を区別する抗体結合推定エスケープの亜種で発見し、継代細胞文化適応または免疫学的選択による野生型ウイルスに必要なアミノ酸残基を識別します。 野生型を含む PCR の製品をクローンまたは pCAGGs 発現ベクター (ノッティと NheI) にバリアント HA をエスケープします。 エスケープ バリアント HA 抗体の結合は 2 つのオプションのいずれか (または両方) 以下と評価できます。 5。抗体結合解析の脱出の亜種 2 x 10 の 4 の密度で 蛍光 プレート 293 t 細胞細胞/ウェルの 96 ウェル プレートで、24 時間 (5% CO 2) と 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。 Transfect pCAGGS プラスミド エスケープ変異 HA の 0.10 μ g/ウェルの細胞、ウイルス HA とトランスフェクション試薬の野生型 HA (unpassaged) を使ってを継代します。 (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 48 h の 96 ウェル プレートをインキュベートします。 室温 15 分 0.5% パラホルムアルデヒドの 修正 100 μ L 注意: パラホルムアルデヒドは咳、息切れが発生し、適度の接触によって皮膚を刺激する揮発性の液状試薬です。それは、潜在的な人間の発癌物質として指定されています。出されたフードの化学試薬の添加を行う必要があります。 3 x 1 PBS で洗浄時間。1 × PBS 室温 1 時間に 5% ミルクでブロック は、3 回を 1 × PBS で洗浄します。5 μ g/ml 室温 1 時間興味の抗体の孵化 の二次抗体 (抗ひとまたは抗マウス アレクサ 488) 暗闇の中で常温 1 時間 PBS/1% BSA × 1 で 1:2,000 の希釈で 100 μ L で加温します。 は、3 回を 1 × PBS で洗浄します。正または負の汚損のための蛍光顕微鏡で細胞を観察します。 蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) 2 x 10 の 5 の密度でプレート 293 t 細胞細胞/ウェル 6 ウェル プレートで、37 ° C (5% CO 2) で 24 時間インキュベート PCAGGS プラスミド エスケープ変異 HA と 0.50 μ g/ウェルの細胞を transfect、ウイルスのみ HA とトランスフェクション試薬を使って野生型 HA を継代します。 (5% CO 2) と 37 ° C で 48 時間 6 ウェル プレートをインキュベートします。 48 時間後吸引成長媒体および 1x PBS で 2 回やさしく洗う (単層が邪魔ではないことを確かめる). は、FACS バッファー (PBS/2% 牛胎児血清 x 1) 500 μ L を transfected 293 t 細胞を収穫します 。 注: FACS バッファーはあらかじめ使用前に 4 ° C で冷蔵する必要があります。 4時 5 分 300 x g で収穫された 293 t 細胞を遠心分離機 ° C は、FACS バッファーを吸引し、関心 (1 に 5 μ g/mL の最終的な集中) の Mab を含む FACS バッファーの 200 μ L で再懸濁します。RT で 20 分間インキュベート は、FACS バッファーの 2 回 500 μ L で 4 ° c. の洗浄で 5 分間 300 x g で細胞を遠心分離機します。ガラス不可、ペレットに関してパスツール ピペットで注意深く吸引します。 は、アレクサ 488 (1:1, 000 の最終的な希釈) に共役二次抗体を含む FACS バッファーの 200 μ L で再懸濁します。20 分のための 4 ° C で暗闇の中で孵化させなさい FACS バッファーの 2 回 500 μ L で 4 ° c. の洗浄で 5 分の 300 g で細胞を遠心し、慎重に洗浄バッファーを吸い出しなさい。 は、FACS バッファーの 500 μ L で再懸濁します、モノクローナル抗体やポリクローナル バインディングを評価FACS による HA 細胞を血清をトランスフェクトした 。 : 注意実験でない mAb/ポリクローナル血清コントロールとして融合のサンプルが含まれています。