דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת
Summary
אנו מתארים שיטה שבאמצעותה אנו מזהים שאריות קריטי הנדרש עבור האיגוד של נוגדנים חד-שבטיים אנושית או מאתר שמכוונות את hemagglutinin נגיפי שפעת A וירוסים. הפרוטוקול ניתן להתאים glycoproteins משטח אחר וירוס, נוגדנים נטרול המתאימים שלהם.
Abstract
וירוסים שפעת להפגין יכולת מדהימה להסתגל, להתחמק את התגובה החיסונית של המארח. אחת הדרכים היא באמצעות antigenic שינויים המתרחשים glycoproteins משטח של הנגיף. הדור של גרסאות הבריחה היא שיטה חזקה שחקרתי כמה וירוסים לחמוק מגילוי המערכת החיסונית, זיהוי שאריות קריטי הנדרש עבור איגוד נוגדן. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול על איך ליצור גרסאות הבריחה של וירוס שפעת A על ידי ניצול אנושי או מאתר נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) נגד את hemagglutinin ויראלי (HA). עם השימוש של הטכניקה שלנו, אנחנו בעבר אפיינו את שאריות קריטי הנדרש עבור האיגוד של נוגדנים מיקוד הראש או גבעול של הרומן העופות H7N9 HA. הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות למערכות אחרות וירוס. ניתוחים של בריחה משתנים חשובים עבור מידול antigenic להיסחף, קביעת פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) היוועצות ההתנגדות וכושר וירוס, ולא של עיצוב של חיסונים ו/או הרפוי.
Introduction
בדומה וירוסים אחרים, ה-RNA, שפעת A וירוסים בעלי של פולימראז לשגיאות המאפשר לדור של מספר רב של גרסאות antigenic עם כל סיבוב של שכפול-1,–2,–3. ה שפעת וירוס יש יכולת מדהימה להסתגל, להתחמק התגובה החיסונית האנושית באמצעות סחיפה antigenic, אשר מושגת באמצעות הצטברות של מוטציות על glycoproteins פני השטח שמוביל האובדן של הנוגדן מחייב. הסחף antigenic של נגיפי glycoproteins פני השטח, הא ו neuraminidase (NA), מחייבת את הצורך ננסח מחדש לנהל את החיסון מדי שנה.
התקדמות טכנולוגית בידוד, דור של אנטיגן ספציפי נוגדנים הניבו מספר גבוה של חיסון-induced mAbs4,5,6,7,8. בתורו, אפיון epitopes של mAbs זה בהרחבה לנטרל וירוסים שפעת A עזר במידה רבה את התפתחות מספר שפעת אוניברסלי חיסון מועמדים9,10,11, 12,13,14. שחקרתי antigenic טביעת רגלו של mAb חושף את גורמים מבניים של ניטרול ומאפשר גישה מושכלת לקראת עיצוב חיסון. עם זאת, זה לא מציאותי ולא חסכונית עבור מעבדות לאפיין מבחינה מבנית לוחות נרחבים של mAbs באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-מיקרוסקופ כדי למפות epitopes אנטיגן ויראלי בכביש15, 16 , 17 , 18.
קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-מיקרוסקופ דורש ציוד יקר, טכניקות מיוחדות שעשויות להיות כמות נרחבת של זמן להפיק נתוני. גישה חלופית ומהירה הוא ניצול הדור מהירה של אוכלוסיות מגוונות ויראלי באמצעות תלויי-RNA לשגיאות RNA פולימראז ליצירת מוטציות לברוח כדי לקבוע את epitopes של mAbs19,20, 21,22,23. הדור של בריחה משתנים ואינו דורש שום ציוד מיוחד או טכניקה, יכול להתבצע עם ריאגנטים המעבדה קונבנציונליות וציוד.
כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת המיפוי של שאריות קריטי הנדרש עבור איגוד mAb לזהות את שפעת HA…
Protocol
התראה: מספר וירוסים שפעת במחזור אוכלוסיית בני האדם (למשל, H1, H3) הם פתוגנים class רמה 2 אבטחה כי חייבים להיות מטופלים עם טיפול ציוד מגן אישי מתאים. טיפול של וירוסים תאושר ע י ועדת הבדיקה מוסדיים. להלן כללי התנהגות אושרה על ידי ועדת הבדיקה מוסדיים במעמד הר סיני. הערה: נוגדנים ספציפיים חה המעכבות שכפול ויראלי בדרך כלל יכולים להיות מסווגים לתוך i) אלה לאגד על או סמוך של אתר איגוד קולטן קצה הראש הכדוריים, ii) אלה לאגד דיסטלי של האיגוד קולטן תחומים, כולל הצד הלטראלי של הראש הכדוריים ובאזור גבעול הוואי. נוגדנים יעד האתר איגוד קולטן ניתן למדוד באמצעות assay עיכוב (איץ ‘ אי) hemagglutination, ולמנוע את האירוסין של מוטיבים sialic חומצה על פני השטח של התאים היעד. נוגדנים המהווים HI-שלילי, כגון נוגדנים ספציפיים גבעול, עדיין יכול לעכב את שכפול ויראלי, אלא יכול רק להיות מוערך באמצעות מבחני ניטרול. 1. לסיווג נוגדנים בהתבסס על HI ופעילויות ניטרול HI assay בצלחת התחתונה V 96-ובכן, להוסיף 25 µL של PBS 1 x על עמודות 2 עד 12- לדלל את 7B2 mAb (ראש-ספציפי), 6F12 (גבעול-ספציפי) 23 ו פקד isotype כדי µg/mL 100 1-PBS ו- aliquot 50 µL של ההכנות נוגדן מדולל לתוך עמודה 1. גם לכלול פקד mAb אין על-ידי הוספת µL 50 ל- PBS 1 x ( איור 1 א’). ביצוע דילולים טורי 2-fold של הנוגדנים על ידי העברת 25 µL מעמודה 1 לעמודה 2, וכך הלאה. למחוק את µL אחרונה 25 מעמודה 12 ( איור 1 א’). הערה: הקפד לכלול שורה של שליטה נוגדן. לדלל את המניה וירוס (נגיף reassortant לבטא את הא ו נה של A/קליפורניה/04/09 עם המקטעים פנימי של A/Puerto ריקו/8/34) hemagglutination 8 יחידות/25 µL מדולל וירוס במלאי. להוסיף 25 µL של המניה וירוס מדולל (8 hemagglutination) כל טוב (שורות A עד G)- הערה: התערובת נוגדן ווירוסים צריך נפח סופי של 50 µL עם ריכוז סופי ההתחלתי של µg 50/mL- Incubate הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 45 דקות עבור השורה האחורית-טיטור (H), להוסיף 50 µL ל- PBS 1 x על בארות H2 H12. להוסיף 100 µL של µL יחידות/25 8 hemagglutination טוב H1. באופן סדרתי לדלל כפולה על-ידי העברת 50 µL מ- H1 H2, וכך הלאה. למחוק את µL אחרונה 50 מ H12 היטב. לבסוף, להוסיף 50 µL של כדוריות דם אדומות של 0.5% עוף (RBC) כל בארות של צלחת V-התחתון 96-ובכן. הערה: הדגימות mAb ב וזמינותו צריך נפח סופי של 100 µL: mAb (25 µL), וירוסים (25 µL) ו- RBC (50 µL). הנפח הסופי של הפקד mAb אין צריך להכיל µL 25 1 x PBS, 25 µL של וירוס, µL 50 של RBC. Incubate הצלחת ב 4 ° C עבור ה 1 לקרוא באופן חזותי את הצלחות לפעילות HI. אם יש הבדיקה חיובית עבור נוגדנים מסוימים, המשך לשלב 2.1 לייצר גרסאות לברוח. אם הנוגדן HI-שלילי, המשך מתחת לצעוד 1.2 כדי להעריך אם הנוגדן נטרול פעילות assay תרבות תא. הערה: מפרט חיובי. של mAb HI-פעיל החלקים מזוהה באמצעות גלולה RBC אדום כהה במרכז באר ( איור 1B 7B2) שיהוו טיפה מדמיע כאשר הצלחת התחתונה V 96-ובכן הוא החזיק בזווית של 45 °. הבדיקה שלילית לא יהוו גלולה RBC אדום כהה בתוך הבאר ( איור 1B 6F12 ו אין mAb). הפקד isotype גם לא בצורת גלולה RBC אדום כהה ולשלוט צריך מראה זהה נוגדן ספציפי גבעול, 6F12 או אין mAb מדגם ( איור 1B) 23- Microneutralization assay תאים צלחת מדין דארבי הכלבי הכליה (MDCK) על צפיפות של 2 x 10 4 תאים/היטב בתרבות רקמה שטופלו לצלחת 96-ובכן, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 עבור h 17-19 . הערה: התאים גם מותר לדבוק בתחתית הבאר לפחות 4 שעות לפני השימוש. בצלחת נפרדת 96-ובכן, לבצע שבע דילולים טורי 3-fold של האדם mAb 4D 05 5, CR9114 17 או isotype IgG בקרת-ריכוז ההתחלתי של 200 µg/mL 1 X בינוני חיוני מינימלי (מאמ) בתוספת tosyl phenylalanyl chloromethyl קטון (TPCK)-מטופלים טריפסין (1 µg/mL) ( איור 2). הערה: Row A צריך להכיל µL 75 של נוגדן מדולל (החל ריכוז של µg 200/mL). באופן סדרתי לדלל (מקופלים ל-. 3) למטה הצלחת על-ידי העברת 25 µL מ- Row A B שורה, וכך הלאה. שורות A H צריך נפח סופי של 50 µL. אין צורך להחליף טיפים בין העברות דילול. לדלל את המניה וירוסים (הווירוס reassortant לבטא את הא ו נה של A/שנגחאי/1/13 עם החלק הפנימי של A/Puerto ריקו/8/34) עד 100 של תרביות רקמה 50% במינון זיהומיות (TCID 50) / µL 50 ב- 1 x MEM בתוספת שטופלו TPCK טריפסין (1 µg/mL) 24. להוסיף µL 50/טוב של וירוס מדולל ההכנות נוגדנים (שלב 1.2.2). להוסיף 50 µL של גברת X 1 הבארות תא נגוע השליטה. דגירה של תערובות וירוס-נוגדן ב חממה 37 ° C (עם 5% CO 2) עבור ה 1 הערה: תערובות וירוס-נוגדן צריך הנפח הכולל של 100 µL: µL 50 של נוגדן דילול (שלב 1.1.2) ו- µL 50 של וירוס המכיל 100 TCID 50 (שלב 1.2.3). וארוקן את המדיה הבארות ולהוסיף את כל µL 100 של וירוס-נוגדן תערובות ולס המתאימות. הערה: השאיפה מתבצעת באמצעות מתאם ערוץ 8 ליניקת המצורפת ואקום. לחלופין, ניתן להשתמש של 8 או 12-ובכן רב-ערוצי מיקרו-פיפטה כדי בוער. כל שאיפה במהלך הסרת inoculum או מנקי נעשית מתוך הריכוז הגבוה ביותר של נוגדן ל הנמוך ביותר, ללא הצורך לשנות טיפים. לרחוץ את טפט עם µL 200 ל- 1 x PBS. האחות µL 200 ל- PBS 1 x (כמו שלב 1.2.5). חזור על השטיפה פעם נוספת עבור סכום כולל של שני מנקי. להדביק טפט של תאים MDCK על-ידי הוספת כל 100 µL/הטוב של תערובות וירוס-נוגדנים (מתוך שלב 1.2.4) על טפט, להדביק/דגירה ב 37 ° C (עם 5% CO 2) עבור ה 1 במהלך הזיהום, בצלחת נפרדת 96-ובכן, להכין קבוצה נוספת של דילולים נוגדן. להוסיף 150 µL של µg/mL 100 של הנוגדן בהתאמה שורה א’ ו- 100 µL של 1 x MEM בתוספת שטופלו TPCK טריפסין (1 µg/mL) ב’ שורות כדי לבצע ה דילולים 3-fold על-ידי העברת 50 µL Row A B שורה , וכן הלאה, עד השורה ה להשליך µL אחרונה 50 מן השורה ה הנפח הכולל עבור כל טוב צריך להיות שווה 100 µL. להפריש. הערה: הנוגדנים הם מדולל ב- x 1 MEM בתוספת שטופלו TPCK טריפסין (1 µg/mL). וארוקן את inoculum וירוס-נוגדן מ טפט בשלב 1.2.7 ו לחדש עם כל 100 µL/הטוב של דילול נוגדן המתאים מוכן בשלב 1.2.8. הערה: אם טוב כלולות ריכוז נוגדן הסופי של µg 100/mL במהלך הזיהום (שלב 1.2.7), ואז התקשורת משקם צריך להכיל גם ריכוז נוגדן הסופי של 100 µg/mL (שלב 1.2.8). Incubate במשך 24 שעות ביממה בחממה 37 ° C (עם 5% CO 2). תשאף המדיה מן הלוחות 96-ובכן. ולשטוף עם 200 µL טוב ל- PBS 1 x 3 פעמים. לתקן את התאים עם 100 µL של אצטון קר 80% עבור h 1 ב-20 מעלות צלזיוס הערה: הפתרון אצטון 80% הוא מדולל זוגי מזוקקים (dd) H 2 O (למשל, 80 מ של אצטון 100% בתוספת 20 מ של ddH 2 0). הפתרון אצטון 80% יכול להיות מקורר על הקרח לפני השימוש. לרחוץ את התאים עם 200 µL טוב ל- 1 X PBS שלוש פעמים. בלוק הצלחות עם 200 µL טוב של 5% חלב מדולל ב- 1 X PBS, דגירה צלחות ב RT עבור ה 1 להוסיף 100 µL של biotinylated נגד שפעת נוגדן ראשוני נוקלאופרוטאין (NP) מדולל 1:2,000 1 x PBS/1% אלבומין שור (BSA), דגירה עומדי ב RT ה 1 הערה: וירוסים שפעת B, נוגדן anti-NP ספציפיים וירוס שפעת B אמור לשמש. לשטוף הצלחות עם PBS 1 x 3 פעמים. להוסיף 100 µL של streptavidin – חזרת peroxidase (HRP) תרכיב נוגדן מדולל 1:3,000 1 x PBS/1% BSA, דגירה הצלחות ב- RT עבור ה 1 לשטוף הצלחות עם µL 200 ל- PBS 1 x 3 פעמים. הוספת ריאגנט המצע HRP-µL 100/טוב, דגירה בחושך-RT. הערה: זמן הדגירה צריך להיות מותאם לפני התוספת של המאגר לעצור חומצי (להלן). באופן כללי, מספיקה 15 עד 30 דקות. להרוות את התגובה עם µL 50/טוב של 5 M HCl. התראה: 5 מ’ HCl הוא ריאגנט קורוזיבית מאוד יכולה לגרום נזק לעיניים, העור והריריות. תוספת של ריאגנט זה צריך להיעשות תחת ברדס פרקו עם ציוד מגן אישי המתאים. לקרוא את הצלחות ב- 492 nm החסר הבארות רקע (תאים נגוע). לחשב אחוז עיכוב עם הנוסחה הבאה: אם נוגדן יש ניטרול פעילות (אין פעילות HI), המשך לשלב 2.2. הערה: נוגדנים חסרי במבחנה ניטרול הפעילות חוסר פעילות HI- 2. הדור של משתנים מוטציה להימלט הערה: נטרול נוגדנים או חוסר פעילות HI מנותחים נוסף עם הפרוטוקולים ספציפיים המתוארים להלן. פרוטוקול 1: נוגדנים HI-חיובי ניטרול-חיובי ( איור 3A ) להכין מלאי וירוס של 10 6 פלאק ויוצרים יחידות/מיליליטר (מ”ל/PFU) ב 1 x PBS ב אמצעי אחסון 400 µL. להכין בארבע דילולים של הנוגדן עניין להגדיל את ריכוז (למשל 0, 0.5, 0.05 ל 0.005 מ”ג/מ”ל) ב- 1 x PBS בנפח של µL 100 לכל דילול. הערה: פראי-סוג וירוס צריך תמיד להיות passaged במקביל, בהיעדרו של נוגדן. הרצפים של וירוסים passaged אלה יסייעו הבחנה בין ההסתגלות תא תרבות תנאים ולברוח מוטציות. מיקס 100 µL של 10 6 PFU/mL של וירוס עם 100 µL של כל דילול נוגדן או µL 100 ל- PBS 1 x. Incubate עבור 1 h בחממה 37 ° C (עם 5% CO 2). מערבולת בקצרה. מזריקים µL 200 של כל תערובת לתוך ביצי תרנגולת של embryonated (SPF) של פתוגן ספציפי-חינם- דגירה הביצים ב 37 מעלות צלזיוס (ללא CO 2) עבור ה 40-44 להקריב את הביצים embryonated נגוע וירוסים מאת המקננת ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 6-אייץ לקצור את הנוזלים allantoic מן הביצים, כפי שתואר לעיל 24 , 25- לבצע את הבדיקה hemagglutination, כפי שתואר לעיל 24 , 26. אם אין כל ההכנות נוזל allantoic hemagglutination titers, חזור משלב 2 עם נוגדן דילולים ועד 0.005 מ”ג/מ”ל 0.00005 מ”ג/מ”ל. הערה: ריכוז נוגדן HI-חיוביות saturating עשויה לנטרל כל חלקיקי וירוס הנוכחי. לפיכך, יתכן ויהיה צורך להקטין את כמות נוגדנים נוכח passaging. לאשר גרסאות לברוח על-ידי ביצוע של HI assay 24 (שלב 1.1). הערה: HI-פעיל נוגדנים לחסום HA האירוסין של מוטיבים sialic חומצה על תאי היעד. לכן, וירוס בנוכחות נוגדן cognate שלו מאבדת את היכולת agglutinate RBCs (נוכחות של RBC גלולה). באופן תיאורטי, הבריחה וריאציות של נוגדנים HI-פעיל עדיין באפשרותך לאגוד מוטיבים sialic חומצה אפילו בנוכחות נוגדן cognate שלה, ובכך יכול agglutinate RBCs (אין גלולה RBC). אם HI של הנוגדן עניין עדיין לזיהוי, חזור על הפרוטוקול משלב 2.1.2 עם ריכוז ההתחלתי גבוה יותר של הנוגדן. פרוטוקול 2: נוגדנים HI-שלילי ניטרול-חיובי ( איור 3B ) הערה: על מנת ליצור גרסאות לברוח נגד נטרול נוגדנים חסרי HI פעילות, הווירוס חייב להיות passaged בנוכחות הגדלת כמויות של נוגדן. תאים MDCK צלחת צלחת 6-ובכן-צפיפות של עונה 1 פרק 10 6 תאים/טוב, תקופת דגירה של מינימום של 4 שעות בחממה 37 ° C (עם 5% CO 2). לדלל את המניה וירוס 10 6 PFU/mL או הווירוס מהקובץ הקודם המעבר 1 x MEM עם שטופלו TPCK טריפסין (1 µg/mL) באמצעי אחסון 500 µL. להכין לדילול יחיד של נוגדנים (0.02 נקודות מ”ג/מ”ל למעבר המקורי או גבוה יותר עבור וכל הבאות מעברים) ב 1 x MEM עם שטופלו TPCK טריפסין באמצעי אחסון 250 µL. µL 250 שילוב של וירוס מדולל עם 250 µL של נוגדן מדולל (+ נוגדנים) או 250 µL 1 x MEM (אין שליטה נוגדנים). דגירה התערובת וירוס-נוגדן למשך 30 דקות בחממה 37 ° C (עם 5% CO 2). וביופסיה פיפטה התקשורת באמצעות כוס פסטר ולשטוף את טפט של תאים עם 1 מ”ל של 1 X PBS- להוסיף 500 µL תערובות לתוך הבארות, דגירה ב חממה 37 ° C (עם 5% CO 2) עבור ה 1 לאחר 1 h, תוספת הבארות 2 מ ל 1 x MEM עם שטופלו TPCK טריפסין (1 µg/mL). לבדוק את התאים ב- 48 שעות לאחר הפגיעה סימנים של ציטופתי (CPE) על המיקרוסקופ או לבצע hemagglutination assay לגילוי נגיפי צמיחה 26. אם יש CPE ברוטו בתרבויות בתוספת נוגדן, לקצור את תגובת שיקוע מרובים הקפאה-צינורות, תווית עם המעבר מספר ואת החנות ב-80 מעלות צלזיוס µL להציל 100 של תגובת שיקוע להדביק טפט טריים של MDCKs עם 2 מ ל 1 x MEM בתוספת TPCK-טריפסין, נוגדן. זכור לכלול פקד נוגדן אין עבור כל מעבר. הערה: להגדיל את ריכוז הנוגדן על ידי כפולה (או שיקול דעתו של החוקר) בקטע הבא (כל יומיים). להעלות את ריכוז הנוגדן בקטע כל-רצופים עד וירוס הצמיחה היא עדיין תקפה גם עם ריכוז סופי של 0.6 מ”ג/מ”ל של נוגדן. להקפיא הבקבוקונים מרובים של תגובת שיקוע של כל מעבר ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס הערה: הפקד נוגדן אין הוא מכריע מאמת את הצמיחה של הווירוס פסקה אחת לאחרת. אם יש CPE ברוטו בפקד נוגדן אין, אבל אין CPE ב + נוגדנים הקבוצה, מציין כי ריכוז הנוגדן היה גבוה מדי, נוצרו גרסאות לא לברוח. אם יש ברוטו CPE בפקד נוגדן אין, אך רק בינוני CPE ב + נוגדנים הקבוצה, זה מעיד על קיומם של משתנים לברוח פוטנציאליים. בקטע הבא, להגביר את עוצמת מעבר ל 200 µL של תגובת שיקוע ולתחזק את הריכוז של נוגדנים כדי להגדיל את הסבירות של יצירת גרסאות לברוח. 3. בידוד לברוח גרסאות דרך רובד טיהור תאים MDCK צלחת צלחת 6-ובכן-צפיפות של עונה 1 פרק 10 6 תאים/טוב, תקופת דגירה של מינימום של 4 שעות בחממה 37 ° C (עם 5% CO 2). לדלל את הנוגדנים 1 x MEM עם טריפסין שטופלו TPCK החל מ- µg/mL 300 באמצעי אחסון של 250 µL, לערבב עם 250 µL של וירוס מוטציה להימלט המתאימים. וירוס passaged בהיעדרו של נוגדן צריך גם להיות רובד מטוהרים. תשאף המדיה מן התאים, לשטוף עם PBS 1 x 3 פעמים ולהוסיף את µL 500 כל תערובת וירוס-נוגדנים (שלב 3.2). דגירה הלוחות עבור 1 h בחממה 37 ° C (עם 5% CO 2) מקפיד רוק הלוך ושוב בכל 10 דקות כדי למנוע התייבשות טפט. וארוקן את תערובות וירוס-נוגדן ויחזיר את הבארות עם כיסוי אגר המדיה המכילה כמויות המקביל של נוגדנים (300 µg/mL; שלב 3.2). דגירה את הצלחת. בשביל 40-44 ש ח בחודש חממה 37 ° C (עם 5% CO 2). מעגל הפלאק גלוי עם סמן בצבע כחול או שחור כדי להקל על האיסוף פלאק. לבחור ארבעה לוחות עבור כל אחד לברוח שילוב וירוס-נוגדן מוטנט, וכן וירוסים פראי-סוג זה היו passaged תאים MDCK או ביצים בהיעדרו של נוגדן. Resuspend את הפלקיו ב 100 µL ל- PBS 1 x. להזריק את µL 100 כולו של וירוס מוטציה להימלט מטוהרים פלאק לביציות עוף embryonated SPF 10 – בן יום. דגירה הביצים במשך 40-44 ש ח בחודש חממה 37 ° C (ללא 5% CO 2). לבצע hemagglutination assay לאשר הנוכחות של וירוסים (שלב 1.1). 4. מיצוי של RNA נגיפי, ניתוח של חה רצף וריאציה µL לחלץ נגיפי רנ א מ- 200 של נוזל allantoic וירוס מוטציה להימלט עם פתרון מונו-phasic של פנול ו guanidine isothiocyanate. התראה: פנול הוא ריאגנט נוזלי נדיף יכול לגרום שיעול, קוצר נשימה, במתינות מגרים את העור על ידי מגע- להגביר את המקטע HA מ RNA נגיפי עם השימוש רוורס טרנסקריפטאז, גנים ספציפיים צבעי יסוד שפעת A חה קטע 27. הערה: צבעי יסוד אוניברסליים וירוסים שפעת B המתוארות בטבלה 2 להגביר את שני של HA (~ 1,800 bp) ו- NA (~ 1,500 bp) 28. לפתור את המוצר RT-PCR ג’ל 1% agarose, לגזור את הלהקה בגודל הנכון (~ 1,800 bp). ג’ל לחלץ המוצר PCR תוך שימוש בתהליך טיהור סיליקה-הממברנה מבוסס, ולשלוח את cDNA עבור רצף. לזהות את שאריות חומצה אמינית הדרוש נוגדן לכריכה על ידי הבחנה מוטציות מצאו על גרסאות לברוח בשם, passaged פראי-סוג וירוס עקב הסתגלות התרבות התא או בחירה אימונולוגי. לשבט את מוצר ה-PCR המכיל הפראי-סוג או מצא מפלט variant HA וקטור ביטוי pCAGGs (NotI ו- NheI). קשירה של הנוגדן כדי לברוח variant HA יכול להידרש עם אחת מתוך שתי אפשרויות (או שניהם) המתואר להלן. 5. הנוגדן מחייב ניתוחים של הבריחה גרסאות תאים 293T Immunofluorescence צלחת על צפיפות של 2 x 10 4 תאים/טוב בצלחת 96-ובכן, דגירה בחממה 37 ° C (עם 5% CO 2) במשך 24 שעות ביממה. Transfect התאים עם 0.10 µg/טוב של פלסמידים pCAGGS קידוד החשבונאי לברוח HA, וירוס passaged HA, ו HA פראי-סוג (unpassaged) עם השימוש של ריאגנט תרביות תאים. דגירה הלוחות 96-ובכן במשך 48 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה (עם 5% CO 2). תיקון עם 100 µL של 0.5% paraformaldehyde למשך 15 דקות ב- RT. התראה: Paraformaldehyde הוא ריאגנט נוזלי נדיף יכול לגרום שיעול, קוצר נשימה, במתינות מגרים את העור על ידי מגע. זה הוכרז בתור חומר מסרטן אנושי פוטנציאלי. תוספת של הכימית צריך להיעשות בשכונה כימי פרקו. לשטוף עם PBS 1 x שלוש פעמים. בלוק עם 5% חלב ב- PBS 1 x עבור 1 h RT. לשטוף עם PBS 1 x שלוש פעמים. דגירה עם 5 µg/mL של נוגדן הריבית עבור 1 h RT. Incubate עם µL 100 של נוגדנים משניים (488 נגד אדם או אנטי-עכבר אלקסה) לדילול 1:2,000 1 x PBS/1% BSA עבור h 1 ב RT בחושך. לשטוף עם PBS 1 x שלוש פעמים. להתבונן התאים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור חיובי או שלילי מכתים. לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית התא מיון (FACS) תאים 293T צלחת על צפיפות של 2 x 10 5 תאים/טוב בצלחת 6-ובכן, דגירה ב 37 ° C (עם 5% CO 2) עבור 24h. Transfect התאים עם µg 0.50/טוב עם פלסמידים pCAGGS קידוד החשבונאי לברוח HA, וירוס רק passaged HA, ו פראי-סוג HA עם השימוש של ריאגנט תרביות תאים. דגירה הלוחות 6-ובכן במשך 48 שעות ב 37 ° C (עם 5% CO 2). לאחר 48 שעות, תשאף התקשורת צמיחה ולא לשטוף עם PBS 1 x פעמיים בעדינות (מוודא כי טפט הוא ללא הפרעה). לקצור את התאים transfected 293T עם µL 500 FACS מאגר (1 x PBS/2% עגל עוברית סרום). הערה: מאגר FACS צריך להיות צונן טרום-ºC 4 לפני השימוש. Centrifuge את התאים 293T שנקטפו ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס תשאף המאגר FACS, resuspend עם µL 200 FACS מאגר המכיל mAbs עניין (הריכוז הסופי של 1 עד 5 µg/mL). תקופת דגירה-RT של 20 דקות Centrifuge התאים ב g x 300 במשך 5 דקות בשטיפת מעלות צלזיוס 4 פעמיים עם 500 µL מאגר FACS. תשאף היטב עם זכוכית פסטר פיפטה כדי לא להפריע בגדר. Resuspend עם µL 200 FACS מאגר המכיל נוגדנים משניים מצומדת כדי אלקסה 488 (סופי דילול של 1:1, 000). דגירה בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות Centrifuge התאים ב 300 גרם במשך 5 דקות בשטיפת מעלות צלזיוס 4 פעמיים עם 500 µL מאגר FACS, בזהירות תשאף המאגר לשטוף. Resuspend ב µL 500 FACS מאגר ולהעריך את הכריכה של mAbs או polyclonal סרה לתאים transfected עם HA מאת FACS. הערה: לזכור לכלול פקד לא סרה mAb/polyclonal, כמו גם דוגמה untransfected לניסוי.
Representative Results
השתמשנו בעבר וריאציות של שיטה זו כדי ליצור גרסאות לברוח כדי mAbs מאתר ואנושי המושרה על ידי חיסון נגד וירוס שפעת עונתית, H7N9 חיסון, או רציפים DNA/רקומביננטי HA חלבון חיסון4,5 ,6,7. כמתואר לעיל, נוגדנים קודם מאופיינים בעזרת את מבחני HI ו- microneutralization כדי להודיע לנו על איזה פרוטוקול ספציפי כדי להמשיך עם4,הבא5. נוגדנים ד 07-5 03, 07-5F01, 07-5 ג’ 01, 07-4B03, 07-4E02 ו- 07-4D 05 נמצאו HI ופעילויות ניטרול נגד הנגיף H7N9 העופות (A/שנגחאי/1/2013) (טבלה 1), ובכך היה מנוצל פרוטוקול 1 (שלב 2.1). עבור mAbs עם לנטרל את חוסר פעילות HI, כגון 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 ו- S6-B01 (טבלה 1), פרוטוקול 2 (שלב 2.2) נעשה שימוש כדי ליצור גרסאות לברוח. מיפוי מוטציה להימלט חשף כי רבים של הנוגדנים מזהה שאריות קריטי במיקומים שונים על נגיפי HA4,5 (איור 4). בעוד רוב הנוגדנים HI-חיובית יש לברוח שאריות מוטציה ליד אתרי antigenic שדווח בעבר של H7 HA, הנוגדנים HI-שלילי שנוצר מוטציות לברוח עם מוטציות נקודה גבעול אזור4,5 . נוגדן היי פעילות NEUT פעילות 07-5D 03 + + 07-5F01 + + 07-5 ג’ 01 + + 07-4B03 + + 07-4E02 + + 07-4D 05 + + 41-5E04 – + 045-051310-2B06 – + 042-100809-2F04 – + S6-B01 – + טבלה 1: שולחן פעילות HI וניטרול נוגדן. MAbs H7 ספציפיים עשר מבודד מאנשים שחוסנו חיסון ניסיוני H7N9 התערוכה שונים במבחנה פעילות אנטי5. פריימר לפנים (5′ ל 3′) הפוך פריימר (5′ ל 3′) תנאי Thermocylcer IAV TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT ºC 42 עבור 60 דקות, ºC 94 2 min/5 מחזורים של 94 ºC עבור 20 s, ºC 50 על 30 s ו- 68 ºC במשך 3 דקות 30 s, ואחריו 40 מחזורי 94 ºC 20 s, ºC 58 על 30 s , ו- 68 ºC עבור 3 דקות 30 s עם זמן סיומת הסופי ב- 68 ºC 10 דקות IBV GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC ºC 45, 60 דקות, ºC 55 במשך 30 דקות, ºC 94 2 min/5 מחזורים של 94 ºC עבור 20 s, ºC 40 ל 30 s ו- 68 ºC במשך 3 דקות 30 s, ואחריו 40 מחזורי 94 ºC 20 s , ºC 58 על 30 s, ו- 68 ºC עבור 3 דקות 30 s עם זמן סיומת הסופי ב- 68 ºC 10 דקות בטבלה 2: תחל וירוס שפעת אוניברסלי- פריימר זוגות עבור ההגברה של המקטעים HA של שפעת A27 , וירוסים28 B, מצבם thermocycler בהתאמה. איור 1: HI assay- מפרטים טכניים עבור ההגדרה למעלה assay HI לבדוק הפעילות של שני העכבר ספציפיים H1 mAbs 7B2 (ראש-ספציפי), 6F12 (גבעול-ספציפי) באמצעות צלחת V-התחתון 96-ובכן, ו- (B) דוגמה של תוצאות וזמינותו HI23(א) א. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: Microneutralization assay. מפרטים טכניים עבור הגדרת assay microneutralization לבחון את הפעילות של שני בני אדם mAbs 4D 055 ו CR911417. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: דור של מוטציות לברוח. המתודולוגיה הציע יהיו תלויים בגבוה הפעילות microneutralization הוצגו על ידי הנוגדן. הדור של בריחה מוטציות נגד (A) נוגדנים HI-חיוביות נטרול עשויים לדרוש קטע אחד קטן, ביצים, בעוד נוגדנים HI-שלילי נטרול (B) עשויה להיות כרוכה מעברים מרובים עם הגדלת סכומי נוגדן תרבית רקמת תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4: דוגמה של מפה של epitope של הרומן העופות H7N9 חה שנוצר עם משתנים מוטציה להימלט. חיסון-induced נוגדנים מבודדים מאנשים שחוסנו מועמד שפעת H7N9 חיסון שימשו כדי ליצור גרסאות מוטציה להימלט. כל שאריות שצוינו האדום מייצג את המיקום של חומצות אמינו קריטי הנדרש עבור איגוד יעיל של mAb. הנתונים היו ממאמרו של Dunand הנרי. et al., 20154. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
אמנם הרוב המכריע של שאריות מזוהה באמצעות מוטציות לברוח היה מדויק, אחד ההליכים העיקריים של גישה זו הוא כי מוטציות נקודה של בריחה משתנים עלול שלא בהכרח ממופה בתוך טביעת רגלו מולקולרית של הנוגדן כפי שנקבע על ידי ניתוחים מבנית. זאת בשל היכולת של מוטציה במשקע מסוימים להוביל לשינוי הסתגלותי דיסטלי למיקום של השאריות שעברו מוטציה, מקביל אפקט allosteric. מגבלה נוספת היא כי מתודולוגיה זו בלבד ניתן ליישם על נטרול נוגדנים; נוגדנים חסרי במבחנה הלחץ הסלקטיבי לא תוביל לברוח מוטציות. עם זאת, מגבלה זו ניתן להתגבר עם השימוש של פאנל של גרסאות לברוח שנוצר על ידי נוגדנים נטרול מאופיין בעבר. השיזוף. et al. בשימוש של וריאנט הבריחה של mAb נטרול הוירוס H7N9 למפות את epitope של נוגדן-נטרול7.
למרות זאת, שחקרתי את epitopes של נוגדנים דרך הדור של בריחה משתנים מספק אלטרנטיבה מעשית קריסטלוגרפיה, הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ, אשר שניהם דורשים השקעה נרחבת של ציוד. חלופות אחרות הן לקבוע האזור איגוד מינימלי של mAbs באמצעות מוטציות סריקה/חיתוך סריקה או פפטיד אלנין. אלנין סריקה מוטגנזה מכוונת עשויים לדרוש כמות משמעותית של עבודה על מנת לייצר מספר גדול של משתנים במהלך ההקרנה29, בעוד פפטיד סריקה מוגבלת ליניארי epitopes30. השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה דורש ציוד מיוחד או טכניקה, למעשה, עושה שימוש הקיים במבחנה ניטרול מבחני שונה כדי ליצור גרסאות הבריחה של נוגדנים עניין.
הפרוטוקול עבור גרסאות לברוח ביצירת הדורשים מעברים מרובים (למשל, נוגדנים ספציפיים גבעול) תלויה מאוד הריכוז ההתחלתי של נוגדן בקטע 0. עדיף במשנה זהירות, מתחילים ב יומן חצי ליומן רישום נמוך יותר מאשר חצי מקסימלי מעכבות ריכוז נוגדן ולאפשר לצמיחה וירוס חזקים. החוקר יכול לשער כי תרבות וירוס כייל נוגדנים גבוה בנוכחות לחץ חיסונית נמוך יהיה וריאציה גנטית גדולה באוכלוסייה ויראלי. הבריחה גרסאות שניתן לבחור עבור הגדלת בהדרגה את ריכוז נוגדן בקטע הבא. במקרה בו הגידול וירוס יורדת, כמות תגובת שיקוע נגיפי ניתן להגדיל ב המעבר הבא תוך שמירה על כמות זהה של ריכוז נוגדן במעבר הקודם.
המטרה של רוב של חיסונים שפעת אוניברסלי היא מביאות לתגובה נוגדנים חזקים לכיוון האזור גבעול הוואי. הניתוחים של בריחה משתנים כדי נוגדנים ספציפיים גבעול חשובים הגדרת קשרי הגומלין בין כושר וירוס שפעת ובלחץ אימונולוגי. מעניין, וירוסים מוטציה להימלט הנובע mAbs גבעול ספציפי היו כל הקלוש ויוו מאתר LD50 מחקרים4. מחקרים אלה מספקים תיק חזק לפלטפורמות החיסונים מבוסס על גבעול. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות מוטציות לברוח כדי תרכובות אנטי-ויראליות אחרות, כגון מעכבי מולקולה קטנה. לבסוף, מתודולוגיה זו אינה מוגבלת glycoproteins משטח של וירוס שפעת, אך גם ניתן באופן נרחב יותר להחיל כדי לקבוע את epitopes של אחרים glycoproteins ויראלי.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה יש כבר מומן בחלקו עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, מכוני הבריאות הלאומיים, מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של, תחת CEIRS חוזה HHSN272201400008C (f. K); NIH U19AI109946-01 (F. K); P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
| Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
| 1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
| Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
| Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
| HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
| 96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
| Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
| Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
| Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
| 6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
| reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |
References
- Shaw, M. L., Palese, P. . Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).
- Nelson, M. I., Holmes, E. C. The evolution of epidemic influenza. Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).
- Lauring, A. S., Andino, R. Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses. PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).
- Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains. J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).
- Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., Lee, P. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Tan, G. S., Leon, P. E., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).
- Smith, K., Garman, L., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Steel, J., Lowen, A. C., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Wang, T. T., Tan, G. S., et al. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).
- Impagliazzo, A., Milder, F., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).
- Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses. Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).
- Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate. mBio. 7 (2), e00257 (2016).
- Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).
- Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies. Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).
- Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin. Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).
- Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants. J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).
- Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Geneva: World Health Organization. . WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J Vis Exp. (97), e52421 (2015).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J Vis Exp. (42), e2057 (2010).
- Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).
- Zhou, B., Lin, X., et al. Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics. J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).
- Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. Exploring and designing protein function with restricted diversity. Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).
- Chen, C. -. W., Chang, C. -. Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J Vis Exp. (121), e55417 (2017).
Cite This Article
Leon, P. E., Wohlbold, T. J., He, W., Bailey, M. J., Henry, C. J., Wilson, P. C., Krammer, F., Tan, G. S. Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies. J. Vis. Exp. (126), e56067, doi:10.3791/56067 (2017).