Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

attention : un certain nombre de virus circulant chez l’homme (par exemple, H1, H3) est pathogènes de classe niveau 2 sur la biosécurité qui doivent être manipulés avec soin et un équipement de protection personnels. Manipulation du virus doit être approuvée par l’Institutional Review Board. Le protocole suivant a été approuvé par le Conseil d’examen institutionnel au Mont Sinaï. Remarque : anticorps HA spécifiques qui inhibent la réplication virale peuvent généralement être classés en i) qui se lient sur ou à proximité du site de fixation du récepteur sur le dessus de la tête globulaire et ii) qui se lient distale de la fixation aux récepteurs domaine, qui comprend la face latérale de la tête globulaire et dans la région de la tige de l’AP. Les anticorps qui ciblent le site de liaison du récepteur empêchent l’engagement de l’acide sialique motifs sur la surface des cellules cibles et peuvent être mesurées par dosage hemagglutination inhibition (HI). Les anticorps HI-négatifs, tels que des anticorps spécifiques à tige, peut encore inhiber la réplication virale, mais ne peut s’évaluer à l’aide de tests de neutralisation. 1. catégoriser anticorps issu des activités de neutralisation et de HI test HI dans une plaque de fond en V 96 puits, ajouter 25 µL de PBS 1 x sur les colonnes 2 à 12. Diluer le mAb 7 b 2 (tête spécifique), 6F12 (tige spécifique) 23 et un contrôle de l’isotype à 100 µg/mL en 1 x PBS et aliquote 50 µL de la préparation d’anticorps dilué dans la colonne 1. Également n’inclure un aucun contrôle de mAb en ajoutant 50 µL de PBS 1 x ( Figure 1 a). Effectuer des dilutions 2 fois des anticorps en transférant 25 µL de colonne 1 colonne 2 et ainsi de suite. Jeter la dernière 25 µL dans colonne 12 ( Figure 1 a). Remarque : Assurez-vous d’inscrire une ligne d’aucun contrôle anticorps. Diluer le stock de virus (un virus réassorti exprimant l’HA et NA de A/California/04/09 avec les segments internes de A/Puerto Rico/8/34) à l’hémagglutination 8 unités/25 µL dilué virus stock. Ajouter 25 µL du stock virus dilué (8 hémagglutination) dans chaque puits (lignes A à G). Remarque : Le mélange des virus et des anticorps doit avoir un volume final de 50 µL avec une concentration finale de départ de 50 µg/mL. Incuber les plaques à température ambiante (RT) pour 45 min. Pour le retour par ligne (H), ajouter 50 µL de PBS 1 x puits H2 à H12. Ajouter 100 µL de le 8 hémagglutination unités/25 µL bien H1. En série diluer deux fois en transférant 50 µL de H1 à H2 et ainsi de suite. Jeter la dernière 50 µL du puits H12. Enfin, ajouter 50 µL de 0,5 % poulet globules rouges (RBC) dans tous les puits de la plaque de fond en V 96 puits. Remarque : Les échantillons de mAb dans le test doivent avoir un volume final de 100 µL : mAb (25 µL), virus (25 µL) et RBC (50 µL). Le volume final du aucun contrôle mAb doit contenir 25 µL de 1 x PBS, 25 µL de virus et 50 µL de RBC. Incuber les plaques à 4 ° C pendant 1 h. Lire visuellement la plaque pour l’activité de HI. S’il y a une lecture positive pour un anticorps particulier, passez à l’étape 2.1 pour générer des variantes de l’évasion. Si l’anticorps est HI-négatif, passer dessous au point 1.2 pour évaluer si l’anticorps a neutraliser l’activité dans un essai de culture cellulaire. Remarque : Une lecture positive d’un mAb HI-actif est indiquée par une pastille de RBC rouge foncée au centre du puits ( Figure 1 b 7 b 2) qui formeront une larme lorsque la plaque de fond en V 96 puits est maintenue à un angle de 45 °. Une lecture négative ne formeront pas une boulette de RBC rouge foncée dans le puits ( Figure 1 b 6F12 et aucun mAb). Aussi le contrôle de l’isotype ne constituera pas une pastille rouge foncée de RBC et d’aspect identique à l’anticorps spécifique au pédoncule, 6F12 ou pas le mAb devait contrôler l’échantillon ( Figure 1 b) 23. Micro-neutralisation test plaque Madin Darby Canine Kidney (MDCK) cellules à une densité de 2 x 10 4 cellules/puits dans une culture de tissus traités plaque 96 puits et incuber à 37 ° C et 5 % de CO 2 de 17 à 19 h . Remarque : Les cellules peuvent également être autorisés à adhérer au fond du puits pendant au moins 4 h avant l’utilisation. Dans une plaque à 96 puits distincte, effectuer sept 3 voies série de dilutions de la mAb humain 4D 05 5, CR9114 17 ou isotype IgG contrôle, à une concentration initiale de 200 µg/mL en 1 X milieu essentiel minimum (MEM) additionné de tosyle phénylalanine chlorométhyl cétone (TPCK)-traité de la trypsine (1 µg/mL) ( Figure 2). NOTE : La ligne A doit contenir 75 µL d’anticorps dilué (à partir de la concentration de 200 µg/mL). En série diluer (3 fois) vers le bas de la plaque en transférant 25 µL de ligne A à la ligne B et ainsi de suite. Lignes A à H doivent avoir un volume final de 50 µL. Il n’y a pas besoin de changer des trucs entre transferts de dilution. Diluer le stock de virus (virus réassorti exprimant l’hémagglutinine et la NA de A/Shanghai/1/13 avec le segment interne de A/Puerto Rico/8/34) à une 100 de culture de tissus de 50 % la dose infectieuse (TCID 50) / 50 µL dans 1 x MEM additionné de TPCK-traitée la trypsine (1 µg/mL) 24. Ajouter 50 µL/puits de virus dilué à la préparation d’anticorps (étape 1.2.2). Ajouter 50 µL de 1 X MEM dans les puits de contrôle de cellules non infectées. Incuber les mélanges virus-anticorps dans un incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2) pendant 1 h. NOTE : Les mélanges d’anticorps du virus doivent avoir un volume total de 100 µL : 50 µL de la dilution de l’anticorps (étape 1.1.2) et 50 µL de virus contenant 100 TCID 50 (étape 1.2.3). Aspirer les médias dans les puits et ajouter l’ensemble 100 µL de mélanges d’anticorps du virus dans les puits correspondants. Remarque : L’aspiration s’effectue à l’aide d’un adaptateur 8 canaux aspirateur attaché à une dépression. Par ailleurs, une micro-pipette multicanaux de 8 ou 12 puits peut servir à aspirer manuellement. Toute aspiration pendant l’enlèvement de l’inoculum ou les lavages se faite à partir de la plus forte concentration d’anticorps au plus bas, sans la nécessité de changer conseils. Laver la monocouche avec 200 µL de solution 1 PBS x. Aspirer 200 µL de PBS 1 x (comme au point 1.2.5). Répéter le lavage une fois de plus pour un total de deux lave-. Infection de la couche des cellules MDCK en ajoutant l’ensemble 100 µL/puits de mélanges d’anticorps du virus (de l’étape 1.2.4) sur la monocouche et infecter/incuber à 37 ° C (avec 5 % de CO 2) pendant 1 h. Au cours de l’infection, dans une plaque à 96 puits distincte, préparer une autre série de dilutions de l’anticorps. Ajouter 150 µL de 100 µg/mL de l’anticorps respectifs dans la ligne A et 100 µL de 1 x MEM additionné de traités TPCK trypsine (1 µg/mL) dans les lignes B à H. réaliser les dilutions 3 fois en transférant 50 µL de ligne A ligne b , et ainsi de suite, jusqu’à la ligne H. jeter la dernière 50 µL de la ligne H. Le volume total pour chaque bien doit égaler 100 µL. infirmer. Remarque : Les anticorps sont dilués dans 1 x MEM additionné de traités TPCK trypsine (1 µg/mL). Aspirer l’inoculum des anticorps du virus de la monocouche à l’étape 1.2.7 et reconstituer avec l’ensemble 100 µL/puits de la dilution appropriée d’anticorps préparé à l’étape 1.2.8. Remarque : Si un bien figurant une concentration d’anticorps final de 100 µg/mL au cours de l’infection (étape 1.2.7), puis les médias reconstituant profond doit également contenir une concentration en anticorps final de 100 µg/mL (étape 1.2.8). Laisser incuber pendant 24 h dans un incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2). Aspirer les médias des plaques 96 puits et laver trois fois, avec 200 µL/puits de PBS 1 x. Fixer les cellules avec 100 µL de froid 80 % acétone pendant 1 h à -20 ° C. Remarque : La solution d’acétone de 80 % est diluée dans double distillée (dd) H 2 O (p. ex., 80 mL d’acétone 100 % plus 20 mL de ddH 2 0). La solution d’acétone de 80 % peut être réfrigérée sur la glace avant utilisation. Laver les cellules avec 200 µL/puits de la solution 1 PBS X trois fois. Bloquer les plaques avec 200 µL/puits de 5 % de lait dilué dans du PBS de X 1 et incuber les boîtes à RT pendant 1 h. Ajouter 100 µL de biotinylé antigrippaux un anticorps primaire de la nucléoprotéine (NP) dilué 1:2,000 dans 1 x PBS/1% d’albumine sérique bovine (BSA) et incuber les boîtes à RT pendant 1 h. Remarque : Pour les virus de l’influenza B, un anticorps d’anti-NP spécifiques du virus influenza de type B doivent être utilisé. Laver trois fois, les plaques avec du PBS 1 x. Ajouter 100 µL de l’anticorps conjugué de streptavidine – raifort peroxydase de raifort (HRP) dilué 1:3,000 dans 1 x PBS/1% BSA et incuber les boîtes à RT pendant 1 h. Laver les plaques avec 200 µL de PBS 1 x trois fois. Ajouter le réactif substrat HRP à 100 µL/puits et incuber dans l’obscurité à température ambiante. NOTE : Le temps d’incubation doit être optimisé avant l’ajout du tampon acide arrêt (ci-dessous). De manière générale, suffit de 15 à 30 min. Étancher la réaction avec 50 µL/puits de 5 M HCl. ATTENTION : 5M HCl est un réactif très corrosif qui peut causer des dommages aux yeux, la peau et des muqueuses. Ajout de ce réactif doit être fait sous une hotte avec un équipement de protection personnel. Lire la plaque à 492 nm et soustraire les puits de fond (les cellules non infectées). Calculer le pourcentage d’inhibition avec la formule suivante : si un anticorps a une activité de neutralisation (et aucune activité de HI), passez à l’étape 2.2. Remarque : Les anticorps qui sont dépourvus d’activité in vitro neutralisation n’aura pas l’activité HI. 2. Génération d’échapper à des variantes de Mutant Remarque : les anticorps neutralisants qui ont ou qui sont dépourvus d’activité HI sont analysés plus loin avec les protocoles spécifiques décrites ci-après. Protocole 1 : anticorps HI-positif/neutralisation-positif ( Figure 3 a ) préparer un stock de virus de 10 6 plaque formant des unités/millilitre (UFP/mL) dans du PBS 1 x dans un volume de 400 µL. Préparer 4 dilutions de l’anticorps d’intérêt en concentrations croissantes (p. ex., 0, 0,5, 0,05 et 0,005 mg/mL) dans du PBS 1 x dans un volume de 100 µL par dilution. Remarque : Le virus de type sauvage devrait toujours être repiquée en parallèle et en l’absence d’anticorps. Les séquences de ces virus passaged aidera à faire la distinction entre l’adaptation aux conditions de culture de cellules et de s’échapper des mutations. Mélanger 100 µL de 10 6 UFP/mL du virus avec 100 µL de chaque dilution d’anticorps ou 100 µL de PBS 1 x. Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2). Vortex brièvement. Injecter 200 µL de chaque mélange des oeufs de poule d’embryonnés spécifiques-pathogène gratuits (SPF). Incuber les œufs à 37 ° C (sans CO 2) pour les 40-44 h. Sacrifier les oeufs embryonnés infectés de virus en incubant à 4 ° C pendant au moins 6 h. Récolter le liquide allantoïdien des oeufs, comme précédemment décrit 24 , 25. Effectuer le test d’hémagglutination, tel que décrit ci-dessus 24 , 26. Si toutes les préparations de liquide allantoïdienne n’ont pas de titres d’hémagglutination, répétition de l’étape 2 avec des dilutions d’anticorps allant de 0,005 mg/mL à 0,00005 mg/mL. Remarque : Une concentration saturante d’anticorps positifs HI peut neutraliser toutes les particules de virus actuelles. Par conséquent, il peut être nécessaire de diminuer la quantité d’anticorps présents dans le passage. Confirmer les variantes d’évasion en effectuant le Salut dosage 24 (étape 1.1). Remarque : Les anticorps HI-active bloquent HA engagement des motifs de l’acide sialique sur les cellules cibles. Donc, un virus en présence de son anticorps apparentés perd la capacité d’agglutiner les globules rouges (présence de pellet RBC). Théoriquement, évasion variantes d’anticorps HI-active peuvent toujours lier des motifs de l’acide sialique même en présence de son anticorps apparentés et donc peuvent agglutiner les globules rouges (sans pastille de RBC). Si le salut de l’anticorps d’intérêt est encore décelable, répétez le protocole de l’étape 2.1.2 avec une concentration plus élevée de départ de l’anticorps. Protocole n ° 2 : anticorps HI-négatif/neutralisation-positif ( Figure 3 b ) Remarque : afin de générer des variantes d’évasion contre la neutralisation des anticorps qui n’ont pas HI activité, le virus doit être repiquée en présence de quantités croissantes d’anticorps. Des cellules de MDCK plaque dans une plaque 6 puits à une densité de 1 x 10 6 cellules/puits et incuber pendant au moins 4 h dans un incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2). Diluer les stocks de virus de 10 6 UFP/mL ou le virus du précédent passage dans 1 x MEM avec imprégnées d’insecticide TPCK trypsine (1 µg/mL) dans un volume de 500 µL. Préparer une dilution unique d’anticorps (0,02 mg/mL pour le passage original ou supérieur pour toute suite de passages) dans 1 x MEM avec de la trypsine TPCK traités dans un volume de 250 µL. Mix 250 µL de virus dilué avec 250 µL d’anticorps dilué (+ les anticorps) ou 250 µL de 1 x MEM (aucun contrôle des anticorps). Incuber le mélange d’anticorps du virus pendant 30 min dans un incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2). Aspirer les médias à l’aide d’un verre Pasteur Pipeter et laver la monocouche de cellules avec 1 mL de solution 1 PBS X. Ajouter 500 µL du mélange dans les puits et incuber dans un incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2) pendant 1 h. Après 1 h, compléter les puits avec 2 mL de 1 x MEM avec TPCK imprégnées de la trypsine (1 µg/mL). Vérifier les cellules à post-infection 48 h pour les signes de l’effet cytopathogène (ECP) sur le microscope ou effectuer un test d’hémagglutination afin de détecter la croissance virale 26. S’il existe des CPE brut dans les cultures additionnés d’anticorps, récolter le surnageant dans plusieurs cryo-tubes, étiquette avec le numéro de passage et les conserver à -80 ° C. Économiser 100 µL du liquide surnageant d’infecter une monocouche frais de MDCKs avec 2 mL de 1 x MEM additionné de TPCK-trypsine et anticorps. N’oubliez pas de n’inclure un contrôle d’aucun anticorps pour chaque passage. NOTE : Augmenter la concentration de l’anticorps par deux fois (ou à la discrétion du chercheur) dans le passage suivant (tous les deux jours). Augmenter la concentration de l’anticorps dans chaque passage successifs jusqu’à ce que la croissance du virus est encore viable même avec une concentration finale de 0,6 mg/mL d’anticorps. Geler les coupes multiples de surnageant de chaque passage et conserver à -80 ° C. Remarque : Aucun contrôle anticorps n’est crucial dans la vérification de la croissance du virus à partir d’un passage à l’autre. S’il y a brut CPE dans le non contrôle de l’anticorps, mais aucun CPE dans le + groupe des anticorps, cela indique que la concentration de l’anticorps était trop élevée et aucun variants d’échappement ont été générés. S’il y a brut CPE dans le non contrôle de l’anticorps, mais seulement modérée des CPE dans le + groupe des anticorps, cela indique la présence de variants d’échappement potentiels. Dans le passage suivant, augmenter le volume de passage à 200 µL de liquide surnageant et maintenir la concentration d’anticorps pour augmenter la probabilité de générer des variantes de l’évasion. 3. Isolement des variantes échapper à travers la Plaque Purification des cellules de MDCK plaque dans une plaque 6 puits à une densité de 1 x 10 6 cellules/puits et incuber pendant au moins 4 h dans un incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2). Diluer les anticorps dans 1 x MEM avec de la trypsine TPCK traités à partir de 300 µg/mL pour un volume de 250 µL et mélanger avec 250 µL de correspondants virus mutant de l’évasion. Virus repiquées en l’absence d’anticorps devraient également être plaque purifié. Aspirer les médias des cellules, laver avec du PBS 1 x trois fois et ajouter l’ensemble 500 µL du mélange anticorps-virus (étape 3.2). Incuber les boîtes pendant 1 h dans un incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2) en veillant à rock en arrière pour éviter le dessèchement de la monocouche toutes les 10 min. Aspirer les mélanges des anticorps du virus et de reconstituer les puits avec les milieux gélosés de superposition contenant une quantité correspondante d’anticorps (300 µg/mL ; étape 3.2). Incuber la plaque pendant 40-44 h dans un incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2). Cercle les plaques visibles avec un marqueur de couleur bleue ou noire pour faciliter la cueillette plaque. Échappent à pick quatre plaques pour chaque combinaison anticorps-virus mutant, ainsi que les virus de type sauvage qui ont été repiquées dans les cellules MDCK ou des oeufs en l’absence d’anticorps. Remettre en suspension la plaque dans 100 µL de PBS 1 x. D’injecter l’ensemble 100 µL de virus mutant de la plaque échappement purifiée dans vieux de 10 jours, œufs de poule embryonnés SPF. Incuber les œufs pendant 40-44 h dans un incubateur à 37 ° C (sans 5 % CO 2). Effectuer un test d’hémagglutination afin de confirmer la présence du virus (étape 1.1). 4. Extraction de l’ARN Viral et Variation de séquence analyse de HA extrait l’ARN viral de 200 µL de liquide allantoïdien de virus mutant échappement avec une solution mono-phasique du phénol et guanidine isothiocyanate. ATTENTION : Le phénol est un réactif liquide volatil qui peut provoquer la toux, essoufflement et modérément irrite la peau par contact. Amplifier le segment HA de l’ARN viral à l’aide d’une transcriptase inverse et des segments de gène-spécifique des amorces pour la grippe A HA 27. Remarque : Les amorces universelles pour le virus de l’influenza B décrits dans le tableau 2 amplifient les deux l’AP (~ 1 800 bp) et le NA (~ 1 500 bp) 28. Résoudre le produit de la RT-PCR dans un gel d’agarose à 1 % et découper la bande correctement taille (~ 1 800 bp). Gel extrait du produit PCR à l’aide d’une méthode de purification de silice-membrane à base et envoyons l’ADNc codant pour l’ordonnancement de. Identifier le résidu d’acide aminé nécessaire à la liaison anticorps en différenciant les mutations trouvé sur variantes évasion putatif et subcultures de virus de type sauvage due à l’adaptation de la culture cellulaire ou immunologique sélection. Clone du produit PCR contenant la souche sauvage ou escape variante HA dans un vecteur d’expression pCAGGs (NotI et NheI). Liaison de l’anticorps à la variante évasion HA pouvant être évaluée par une des deux options (ou les deux) décrites ci-dessous. 5. Anticorps contraignantes Analyses d’échapper variantes cellules 293 t Immunofluorescence plaque à une densité de 2 x 10 4 cellules/puits dans une plaque à 96 puits et incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 h (avec 5 % de CO 2). Transfecter les cellules avec 0,10 µg/puits des plasmides codant le mutant évasion HA pCAGGS, virus subcultures HA et HA sauvage (unpassaged) grâce à l’utilisation d’un réactif de transfection. Incuber les plaques à 96 puits pendant 48 h dans incubateur à 37 ° C (avec 5 % de CO 2). Fix avec 100 µL de paraformaldéhyde à 0,5 % pendant 15 min à température ambiante. ATTENTION : Paraformaldéhyde est un réactif liquide volatil qui peut provoquer la toux, essoufflement et modérément irrite la peau par contact. Il a été désigné comme un potentiel cancérogène pour les humain. Ajout du réactif doit être fait dans une hotte chimique. Lavage avec du PBS 1 x trois fois. Bloc avec du lait de 5 % dans du PBS 1 x pendant 1 h à température ambiante. Laver avec du PBS 1 x trois fois. Incuber 5 µg/ml d’anticorps d’intérêt pendant 1 h à température ambiante. Incuber avec 100 µL d’anticorps secondaire (anti-humain ou anti-souris Alexa 488) à une dilution de 1:2,000 en 1 x PBS/1% BSA pendant 1 h à RT dans l’obscurité. Laver avec du PBS 1 x trois fois. Observer les cellules sur un microscope à fluorescence pour coloration positive ou négative. Tri cellulaire activés par fluorescence (FACS) cellules 293 t plaque à une densité de 2 x 10 5 cellules/puits dans une plaque 6 puits et incuber à 37 ° C (avec 5 % de CO 2) pendant 24 h. Transfecter les cellules avec 0,50 µg/puits avec pCAGGS plasmides codant le mutant évasion HA, virus subcultures seulement HA et HA sauvage avec l’utilisation d’un réactif de transfection. Incuber les plaques 6 puits pendant 48 h à 37 ° C (avec 5 % de CO 2). Après 48 h, aspirer les milieux de culture et les laver avec du PBS 1 x deux fois doucement (en vous assurant que la monocouche est intacte). Récolter les cellules 293 t transfectées avec 500 µL de tampon de FACS (1 x PBS/2% sérum de veau foetal). Remarque : Tampon de FACS doit être préalablement réfrigérée à 4 ° c avant utilisation. Centrifuger les cellules 293 t récoltées à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le tampon de FACS et remettre en suspension avec 200 µL de tampon de FACS contenant du mAbs d’intérêt (concentration finale de 1 à 5 µg/mL). Incuber à RT pendant 20 min. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Laver deux fois avec 500 µL de tampon de FACS. Aspirez soigneusement avec une pipette Pasteur en verre pour ne pas déranger le culot. Remettre en suspension avec 200 µL de tampon de FACS contenant l’anticorps secondaire conjugué à Alexa 488 (dilution finale de 1:1, 000). Incuber dans l’obscurité à 4 ° C pendant 20 min. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Laver deux fois avec 500 µL de tampon de FACS et aspirer soigneusement le tampon de lavage. Resuspendre dans 500 µL de tampon de FACS et d’évaluer la liaison du mAbs et/ou polyclonal sérums aux cellules transfectées avec HA par FACS. Remarque : N’oubliez pas d’inclure un aucun contrôle Sérum polyclonal/mAb ainsi qu’un échantillon celllulaire dans l’expérience.