Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Let op: een aantal influenza-virussen die circuleren in de menselijke populatie (bijvoorbeeld H1, H3) zijn bioveiligheid niveau 2 klasse ziekteverwekkers die met zorg en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden behandeld. Behandeling van virussen moet worden goedgekeurd door de institutionele Review Board. Het volgende protocol is goedgekeurd door de institutionele Review Board op Mount Sinai. Opmerking: HA-specifieke antilichamen die remmen van de virale replicatie in het algemeen kunnen worden onderverdeeld in i) degenen die op of in de nabijheid van de receptor bindende site bovenop de bolvormige kop binden en ii) die distale van de receptor-binding binden domein, waaronder de laterale kant van de bolvormige kop en de regio van de stengel van de HA. Antilichamen die gericht zijn op de site van de bindende receptor te voorkomen dat de betrokkenheid van sialic zuur op het oppervlak van de doelcellen motieven en kunnen worden gemeten met behulp van een hemagglutination inhibitie (HI) test. Antilichamen die HI-negatief, zoals stengel-specifieke antilichamen, virale replicatie nog steeds kunnen remmen, maar kan alleen worden uitgevoerd met behulp van de neutralisatie testen. 1. categoriseren antilichamen op basis van HI en neutralisering activiteiten HI assay In een 96-Wells V-bodemplaat, voeg 25 µL van 1 x PBS op kolommen 2 tot en met 12. Verdun de mAb 7B2 (hoofd-specifiek), 6F12 (Steel-specifiek) 23 en een besturingselement isotype tot 100 µg/mL in 1 x PBS en aliquoot 50 µL van de voorbereidingen van de verdunde antilichaam in kolom 1. Ook een geen mAb-controle door de toevoeging van 50 µL van 1 x PBS ( figuur 1A). 2-fold seriële verdunningen van de antilichamen uitvoeren door overdracht van 25 µL van kolom 1 naar kolom 2, enzovoort. Negeren van de laatste 25 µL uit kolom 12 ( figuur 1A). Opmerking: Zorg ervoor dat een rij van antilichaam oncontroleerbaar. Verdun de virus voorraad (een reassortant virus uiting te geven aan de HA en NA van A/Californië/04/09 met de interne segmenten van Rico/8/34 van de A/Puerto) tot 8 hemagglutination eenheden/25 µL verdund virus voorraad. Voeg 25 µL van de verdunde virus voorraad (8 hemagglutination) aan elk putje (rijen A tot G). Opmerking: Het antilichaam en virus mengsel moet een eindvolume van 50 µL met een startende eindconcentratie van 50 µg/mL. Incubate de plaat bij kamertemperatuur (RT) voor 45 min. Voor de rij terugtitrering (H) 50 µL van 1 x PBS op wells H2 aan toevoegen H12. Voeg 100 µL van de 8 hemagglutination eenheden/25 µL goed H1. Serieel twee-voudige verdunnen door 50 µL van H1 aan H2, enzovoort. De laatste 50 µL van goed H12 negeren. Ten slotte voeg 50 µL van 0,5% kip rode bloedcellen (RBC) aan alle putjes van de 96-Wells-V-bodemplaat. Opmerking: De mAb-samples in de bepaling moet een eindvolume van 100 µL: mAb (25 µL), virus (25 µL) en RBC (50 µL). Het uiteindelijke volume van de geen mAb-controle moet bevatten 25 µL 1 x PBS, 25 µL van virus en 50 µL van RBC. Incubate de plaat bij 4 ° C gedurende 1 h. Visueel Lees de platen voor HI-activiteit. Als er een positieve uitlezing voor een bepaald antilichaam, gaat u verder met stap 2.1 voor het genereren van escape varianten. Als het antilichaam HI-negatieve is, ga hieronder naar stap 1.2 te beoordelen als het antilichaam heeft neutraliserende activiteit in een cel cultuur assay. Opmerking: Een positieve uitlezing van een HI-actieve mAb wordt aangegeven door een donker rode RBC pellet in het midden van een goed ( figuur 1B 7B2) die een daling van de scheur vormen zullen wanneer de 96-Wells-V-bodemplaat wordt gehouden in een hoek van 45 °. Een negatieve uitlezing zal niet vormen een donker rode RBC pellet in de put ( figuur 1B 6F12 en geen mAb). Het besturingselement isotype zal ook niet vormen een donker rode RBC pellet en moet uiterlijk identiek zijn aan de stengel-specifieke antilichaam, 6F12 of de geen mAb controle monster ( figuur 1B) 23. Microneutralization test plaat Madin Darby Canine Kidney (MDCK) cellen bij een dichtheid van 2 x 10, 4 cellen per putje in een Weefselkweek behandeld 96-wells-plaat en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 17 tot en met 19 h . Opmerking: De cellen kunnen ook worden toegestaan zich te houden aan de bodem van de put gedurende ten minste 4 uur vóór gebruik. In een afzonderlijke 96-wells-plaat, uitvoeren van zeven 3-voudig seriële verdunningen van het menselijke mAb 4D 05 5, CR9114 17 of isotype IgG control, op een beginconcentratie van 200 µg Fe/mL in 1 X minimaal essentiële Medium (MEM) aangevuld met tosyl phenylalanyl chloormethyl keton (TPCK)-behandeld trypsine (1 µg/mL) ( Figuur 2). Opmerking: Rij A moet 75 µL van verdunde antilichaam (vanaf concentratie van 200 µg/mL) bevatten. Serieel verdunnen (3 katernen) beneden de plaat door overdracht van 25 µL van rij A naar B rij, enzovoort. Rijen A tot H moet een eindvolume van 50 µL. Er is geen behoefte te veranderen tips tussen verdunning overdrachten. Het virus voorraad (reassortant virus uiting geven aan de HA en de nb van A/Shanghai/1/13 met de interne segment van A/Puerto Rico/8/34) verdund tot een 100 van 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID 50) / 50 µL in 1 x MEM aangevuld met TPCK behandeld trypsine (1 µg/mL) 24. 50 µL per putje van verdunde virus aan de voorbereidingen van het antilichaam (stap 1.2.2) toevoegen. 50 µL van 1 X MEM toevoegen aan de niet geïnfecteerde cel-controleputjes. Broeden de mengsels van de virus-antilichaam in een incubator van de 37 ° C (met 5% CO 2) voor 1 h. Opmerking: Het virus-antilichaam mengsels moeten een totaal volume van 100 µL: 50 µL van antilichaam verdunning (stap 1.1.2) en 50 µL van het virus met 100 TCID 50 (stap 1.2.3). Gecombineerd van de media in de putjes en voeg de hele 100 µL van virus-antilichaam mengsels toe aan overeenkomstige putjes. Opmerking: De aspiratie wordt gedaan met behulp van een 8-kanaals aspirator adapter aangesloten op een vacuüm. U kunt ook kan een 8 – of 12-well micro-meerkanaalspipet worden gebruikt om handmatig gecombineerd. Alle aspiratie tijdens de entmateriaal verwijdering of wast gebeurt vanuit de hoogste concentratie van antilichaam aan de laagste, zonder de noodzaak om te veranderen tips. Wassen de enkelgelaagde met 200 µL van 1 x PBS. Gecombineerd 200 µL van 1 x PBS (zoals in stap 1.2.5). Herhaal het wassen nogmaals voor een totaal van twee wasbeurten. Verpesten de enkelgelaagde MDCK cellen door toevoeging van de hele 100 µL per putje van virus-antilichaam mengsels (uit stap 1.2.4) op de enkelgelaagde en infecteren/Incubeer bij 37 ° C (met 5% CO 2) voor 1 h. Tijdens de infectie, in een afzonderlijke 96-wells-plaat, bereiden een andere set van antilichaam verdunningen. Voeg 150 µL van 100 µg/mL van het respectieve antilichaam in rij en 100 µL van 1 x MEM aangevuld met TPCK behandeld trypsine (1 µg/mL) in rijen B bij H. uitvoeren 3-voudig verdunningen 50 µL van rij A overbrengen naar rij B , enzovoort, tot rij H. negeren de laatste 50 µL van rij H. Het totale volume voor elk goed moet gelijk zijn aan 100 µL. gereserveerd. Opmerking: De antilichamen worden verdund in 1 x MEM aangevuld met TPCK behandeld trypsine (1 µg/mL). Het virus-antilichaam entmateriaal uit de enkelgelaagde in stap 1.2.7 gecombineerd en aangevuld met de gehele 100 µL per putje van de verdunning van de passende antilichaam bereid in stap 1.2.8. Opmerking: Als een goed staand een definitieve antilichaam concentratie van 100 µg/mL gedurende de infectie (stap 1.2.7), dan de bijvullen media moet ook een definitieve antilichaam concentratie van 100 µg/mL (stap 1.2.8) bevatten. Incubate gedurende 24 uur in een incubator 37 ° C (met 5% CO 2). Gecombineerd van de media van de 96-wells-platen en wassen met 200 µL per putje van 1 x PBS driemaal. Herstellen de cellen met de 100 µL van koude 80% aceton gedurende 1 uur bij -20 ° C. Opmerking: De 80% aceton oplossing wordt verdund in dubbel gedestilleerd (dd) H 2 O (b.v., 80 mL 100% aceton plus 20 mL ddH 2 0). De 80% aceton oplossing kan worden gekoeld op ijs vóór gebruik. Spoel de cellen met 200 µL per putje van 1 X PBS driemaal. Blok de platen met 200 µL per putje van 5% melk verdund in 1 X PBS en incubeer platen op RT voor 1 h. Voeg 100 µL van biotinyleerd anti-influenza een nucleoproteïne (NP) primair antilichaam 1:2,000 in 1 x PBS/1% bovien serumalbumine (BSA) verdund en Incubeer de platen bij RT voor 1 h. Opmerking: Voor influenza B-virussen, een influenza B-virus-specifieke anti-NP-antilichaam moet worden gebruikt. Wassen van de platen met 1 x PBS driemaal. Voeg 100 µL van daar-paard radijs peroxidase (HRP) geconjugeerde antilichaam 1:3,000 in 1 x PBS/1% BSA verdund en Incubeer de platen bij RT voor 1 h. Wassen van de platen met 200 µL van 1 x PBS driemaal. Toevoegen van HRP substraat reagens op 100 µL per putje en broeden in het donker bij RT. Opmerking: De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd voor de toevoeging van de zure stoppen buffer (zie hieronder). Over het algemeen 15 tot 30 min volstaat. Quench de reactie met 50 µL per putje van 5 M HCl. Let op: 5M HCl is een sterk bijtende reagens dat leiden schade aan de ogen, huid en slijmvliezen tot kan. Toevoeging van dit reagens moet worden uitgevoerd onder een geventileerde kap met goede persoonlijke beschermingsmiddelen. Lees de platen bij 492 nm en aftrekken van de achtergrond (niet-geïnfecteerde cellen) putten. Berekenen de percentage remming met de volgende formule: als een antilichaam heeft neutralisatie activiteit (en geen HI-activiteit), gaat u verder met stap 2.2. Opmerking: Antilichamen die in vitro neutralisatie activiteit ontbreken zal ontbreken HI activiteit. 2. Generatie van ontsnappen Mutant varianten Opmerking: neutraliserende antilichamen die hebben of het ontbreken van HI activiteit verder worden geanalyseerd met de specifieke protocollen die hieronder worden beschreven. Protocol 1: HI-positieve/neutralisatie-positieve antistoffen ( figuur 3A ) bereiden een virus voorraad van 10 6 plaque eenheden/milliliter (PFU/mL) in 1 x PBS in vormen een volume van 400 µL. Maak vier verdunningen van het antilichaam van belang in toenemende concentraties (bv 0, 0,5, 0,05 en 0,005 mg/mL) in 1 x PBS in een volume van 100 µL per verdunning. Opmerking: Wild-type virus moet altijd worden gepasseerd in parallel en het ontbreken van antilichaam. De sequenties van deze passaged virussen zal helpen bij het onderscheid te maken tussen aanpassing aan cel kweekomstandigheden en mutaties ontsnappen. Mix 100 µL van 10 6 PFU virus met 100 µL van elke verdunning antilichaam of 1 x PBS 100 µL/mL. Incubate gedurende 1 uur in een incubator 37 ° C (met 5% CO 2). Vortex kort. Injecteren van 200 µL van ieder mengsel in specifieke-pathogeen gratis (SPF) bebroede kippeneieren. Incubeer de eieren bij 37 ° C (zonder CO 2) voor 40-44-h. Het virus besmet-bebroede eieren door broeden bij 4 ° C gedurende ten minste 6 h. offeren Oogst de allantoïsvocht van de eieren, als eerder beschreven 24 , 25. Voert de hemagglutination assay, zoals beschreven hierboven 24 , 26. Als alle van de allantoïs vloeibare preparaten geen hemagglutination titers, herhaal vanaf stap 2 met antilichaam verdunningen variërend van 0,005 mg/mL tot 0.00005 mg/mL. Opmerking: Een saturating concentratie van een HI-positieve antilichaam kan neutraliseren alle virusdeeltjes aanwezig. Daarom, kan het nodig zijn tot vermindering van de hoeveelheid antistoffen aanwezig zijn in de passaging. Bevestigen de varianten van de ontsnapping door het uitvoeren van de HI assay 24 (stap 1.1). Opmerking: HI-actieve antistoffen blokkeren HA betrokkenheid van sialic zuur motieven op de doelcellen. Dus, een virus in het bijzijn van haar cognaat antilichaam verliest de mogelijkheid om te agglutineert van RBC (aanwezigheid van RBC pellet). Theoretisch, escape varianten van HI-actieve antilichamen nog sialic zuur motieven zelfs in aanwezigheid van haar cognaat antilichaam kunnen binden en dus kunnen agglutineert RBC (geen RBC pellet). Als de HI van het antilichaam van belang nog steeds aantoonbaar is, herhaalt u het protocol uit stap 2.1.2 met een hogere beginconcentratie van het antilichaam. Protocol 2: HI-negatief/neutralisatie-positieve antistoffen ( figuur 3B ) Opmerking: om te ontsnappen varianten tegen neutraliserende antilichamen die geen HI genereren activiteit, het virus in het bijzijn van de steeds grotere hoeveelheden van antilichaam moet worden gepasseerd. Plaat MDCK cellen in een 6-well plaat duikt met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen per putje en incubeer gedurende een minimum van 4 uur in een incubator 37 ° C (met 5% CO 2). Verdund het virus voorraad tot en met 10 6 PFU/mL of het virus uit vorige passage in 1 x MEM met TPCK behandeld trypsine (1 µg/mL) in een volume van 500 µL. Bereiden een enkelvoudige verdunning van antilichaam (0,02 mg/mL voor de oorspronkelijke passage of hoger voor alle volgende passages) in 1 x MEM met trypsine TPCK-behandeld in een volume van 250 µL. Mix 250 µL van verdunde virus met 250 µL van verdunde antilichaam (+ antilichaam) of 250 µL van 1 x MEM (geen controle van antilichaam). Het virus-antilichaam mengsel gedurende 30 min. in een incubator 37 ° C (met 5% CO 2) incuberen. Aspirate de media met behulp van een glas Pasteur Pipetteer en wassen van de enkelgelaagde van cellen met 1 mL 1 X PBS. Voeg 500 µL van het mengsel in de putjes en broeden in een incubator van de 37 ° C (met 5% CO 2) voor 1 h. Na 1 h, vullen de putjes met 2 mL 1 x MEM met TPCK behandeld trypsine (1 µg/mL). Controleer de cellen op 48 uur na infectie voor tekenen van cytopathogeen effect (CPE) over de Microscoop of uitvoeren van een hemagglutination-assay voor het detecteren van virale groei 26. Als er grove CPE in de culturen aangevuld met antilichaam, oogst het supernatant in meerdere cryo-buizen, label met de passage nummer en winkel op -80 ° C. Opslaan 100 µL van de bovendrijvende substantie te infecteren een verse enkelgelaagde van MDCKs met 2 mL 1 x MEM aangevuld met TPCK-trypsine en antilichaam. Vergeet niet om een antilichaam oncontroleerbaar voor elke passage. Opmerking: Toename van de concentratie van het antilichaam door twee-voudige (of ter beoordeling van de onderzoeker) de volgende passage (om de twee dagen). Verhoging van de concentratie van het antilichaam in elke opeenvolgende passage tot virus groei nog steeds haalbaar zelfs met een eindconcentratie van 0,6 mg/mL van antilichaam is. Bevriezen de meerdere flesjes van supernatant van elke passage en bewaren bij -80 ° C. Opmerking: De geen antilichaam-controle is cruciaal bij het controleren van de groei van virus vanuit één passage naar de andere. Als er bruto CPE in de geen antilichaam-controle, maar geen CPE in de + antilichaam groep, dit betekent dat de concentratie van het antilichaam te hoog was en geen ontsnappen varianten werden gegenereerd. Als er bruto CPE in de oncontroleerbaar van antilichaam, maar slechts matig CPE in de + antilichaam groep, dit duidt op de aanwezigheid van potentiële ontsnappen varianten. In de volgende passage, Verhoog het volume van de passage naar 200 µL van supernatant en onderhouden van de concentratie van antilichaam aan vergroot u de kans voor het genereren van escape varianten. 3. Isolatie van ontsnappen varianten door de zuivering van de Plaque plaat MDCK cellen in een 6-well plaat duikt met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen per putje en incubeer gedurende een minimum van 4 uur in een incubator 37 ° C (met 5% CO 2). Verdun de antilichamen in 1 x MEM met TPCK behandeld trypsine basisgewicht van 300 µg/mL in een volume van 250 µL en mix met 250 µL van overeenkomstige ontsnappen gemuteerde virus. Virus gepasseerd bij gebrek aan antilichaam moet ook plaque gezuiverd. Gecombineerd van de media van de cellen, driemaal met PBS 1 x wassen en voeg de gehele 500 µL van het mengsel van virus-antilichaam (stap 3.2). Incubeer de platen gedurende 1 uur in een incubator 37 ° C (met 5% CO 2) ervoor zorgend om de rots heen en weer om de 10 min om te voorkomen dat het drogen van de enkelgelaagde. Het virus-antilichaam mengsels gecombineerd en de putjes vullen met overlay agarmedia met overeenkomstige hoeveelheden van antilichaam (300 µg/mL; stap 3.2). De plaat voor 40-44 h in een incubator 37 ° C (met 5% CO 2) incuberen. Cirkel van de zichtbare plaques met een blauw-gekleurde of zwarte marker om plaque picken. De vier plaques pick voor elk ontsnappen gemuteerde virus-antilichaam combinatie, evenals wild-type virussen die waren gepasseerd in MDCK cellen of eieren in de afwezigheid van antilichaam. Resuspendeer de plaque in 100 µL van 1 x PBS. De hele 100 µL van plaque gezuiverde ontsnappen gemuteerde virus injecteren 10 – dag oud SPF bebroede kippeneieren. Broeden de eieren voor 40-44 h in een incubator 37 ° C (zonder 5% CO 2). Uitvoeren van een hemagglutination bepaling ter bevestiging van de aanwezigheid van virus (stap 1.1). 4. Winning van viraal RNA en analyse van HA reeks variatie Extract het virale RNA vanaf 200 µL van escape gemuteerde virus allantoïsvocht met een mono-phasic oplossing van fenol en guanidine isothiocyanaat. Let op: Fenol is een vluchtige vloeibare reagens dat kan leiden tot hoesten, kortademigheid en matig irriteert de huid door contact. Versterken de HA segment van de virale RNA met het gebruik van een reverse-transcriptase en gen-specifieke primers voor de influenza A HA segment 27. Opmerking: De universele inleidingen voor influenza B-virussen beschreven in tabel 2 versterken beide de HA (~ 1800 bp) en de waarde N.V.T. (~ 1500 bp) 28. Oplossen van de RT-PCR-product in een 1% agarose gel en knip de correct formaat band (~ 1800 bp). Gel extract het PCR-product met de silica-membraan gebaseerd zuivering procedure en cDNA afgeven voor het rangschikken. Identificatie van het aminozuur residu vereist voor antilichaam binding door te differentiëren van de mutaties op vermeende ontsnappen varianten gevonden en wild-type virus omdat de cel cultuur aanpassing of immunologische selectie gepasseerd. Kloon van het PCR-product met de wild-type of variant HA ontsnappen in een pCAGGs expressie vector (kennisgevingen en NheI). Binding van het antilichaam de escape variant HA kan worden beoordeeld met een van de twee opties (of beide) die hieronder worden beschreven. 5. Antilichamen bindende Analyses van ontsnappen varianten immunofluorescentie plaat 293T cellen bij een dichtheid van 2 x 10 4 cellen per putje in een 96-wells-plaat en broeden in de incubator van de 37 ° C (met 5% CO 2) gedurende 24 uur. Transfect van de cellen met 0,10 µg per putje van de plasmiden van de pCAGGS, de codering van de escape mutant HA, virus gepasseerd HA en wild-type HA (unpassaged) met behulp van een transfectiereagens. Incubeer de 96-wells-platen gedurende 48 uur in 37 ° C incubator (met 5% CO 2). Fix met 100 µL van 0,5% paraformaldehyde gedurende 15 minuten op RT. Let op: Paraformaldehyde is een vluchtige vloeibare reagens dat kan leiden tot hoesten, kortademigheid en matig irriteert de huid door contact. Zij is aangewezen als een potentiële menselijk carcinogeen. Toevoeging van het reagens moet gebeuren in een geventileerde chemische kap. Wassen met PBS 1 x drie keer. Blok met 5% melk in 1 x PBS voor 1 h op RT. Wassen met PBS 1 x drie keer. Incubeer met 5 µg/mL van antilichaam van belang voor 1 h op RT. Met 100 µL van secundair antilichaam (anti-mens of anti-muis Alexa 488) bij een verdunning 1:2,000 in 1 x PBS/1% BSA voor 1 h bij RT in het donker Incubate. Wassen met PBS 1 x drie keer. Observeren van de cellen op een fluorescente microscoop voor positieve of negatieve kleuring. Fluorescentie-activated Cell Sorting (FACS) plaat 293T cellen bij een dichtheid van 2 x 10, 5 cellen/well in een 6-well-plate en Incubeer bij 37 ° C (met 5% CO 2) voor 24 h. Transfect van de cellen met 0,50 µg per putje met pCAGGS plasmiden codering van de escape mutant HA, virus alleen gepasseerd HA en wild-type HA met het gebruik van een transfectiereagens. Broeden de 6-Wells-platen gedurende 48 uur bij 37 ° C (met 5% CO 2). Na 48u, gecombineerd de groei media en wassen met PBS 1 x twee keer voorzichtig (om ervoor te zorgen dat de enkelgelaagde ongestoord is). Oogst de cellen transfected 293T met 500 µL van FACS buffer (1 x PBS/2% foetaal kalfsserum). Opmerking: FACS buffer moet vooraf gekoeld bij 4 ° c vóór gebruik. De geoogste 293T cellen bij 300 x g gedurende 5 min Centrifugeer bij 4 ° C. De buffer FACS gecombineerd en resuspendeer met 200 µL van FACS buffer met mAbs van belang (eindconcentratie van 1 tot en met 5 µg/mL). Incubeer bij RT gedurende 20 min. Centrifugeren de cellen bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. wassen twee keer met 500 µL van FACS buffer. Zorgvuldig gecombineerd met een glazen pipet van Pasteur dat niet storen de pellet. Resuspendeer met 200 µL van FACS buffer met secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa 488 (in de uiteindelijke verdunning van 1:1, 000). Incubeer in het donker bij 4 ° C gedurende 20 min. Centrifugeren van de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. wassen twee keer met 500 µL van FACS buffer en zorgvuldig gecombineerd de buffer wassen. Resuspendeer in 500 µL van FACS buffer en beoordelen van bindende voor mAbs en/of polyclonal sera naar cellen transfected met HA door FACS. Nota: Herinner me om een oncontroleerbaar van mAb/polyklonale sera, alsmede een untransfected monster opnemen in het experiment.