JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Published: December 06, 2017
doi:
10.3791/56061
, ,
1Sensors and Electron Devices Directorate,US Army Research Laboratory

Summary

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Abstract

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktif bulma biyotik ve abiyotik hedefleri tanınması için kanıtlanmış bir tekniktir. Peptid benzeşme reaktifler antikorlar, algılama ve tedavi, dahil olmak üzere için benzer uygulamalar için kullanılabilir ancak daha sağlam ve daha fazla aşırı ortamlarda gerçekleştirmek edebiliyoruz. Protein hedefine ilgi peptid yakalama ajanların belirli zenginleştirme bağlama geliştirmek ve adımları yıkayın ve bu nedenle yanlış pozitif bağlayıcı oluşumunu azaltmak yarı otomatik sıralama yöntemi kullanılarak geliştirilmiştir. Yarı otomatik bir sıralama yöntemi, burada kullanım için aygıt kısıtlamasız bir bakteriyel ekran rasgele 15-mer peptidler ifade Kütüphane sıralama sıralama bir ticari otomatik manyetik aktif hücre ile tanımlanır. Hafif değişiklikler ile bu yöntemler için diğer Genişletilebilir otomatik cihazlar, sıralama diğer kütüphaneler ve diğer organizmalar. Bu eser birincil amacı kapsamlı bir metodoloji sağlamak ve analiz etme ve elde edilen aday havuzu minimize uygulanan düşünce süreci açıklamak olduğunu. Bu teknikler benzeşme ve özgüllük bireysel adaylar, karşılaştırma ve sıralama sırasında değerlendirmek için Floresans aktif hücre (FACS), sıralama kullanarak hücre içi bağlama analizini içerir ve peptid analiz dizileri eğilimlerini tespit etmek ve fikir birliği sıralarını anlama ve potansiyel olarak benzeşimi ve özgüllük faiz hedefi için arttırmak için.

Introduction

Biopanning benzeşme reaktif keşif için kanıtlanmış bir tekniktir, bakteriyel ile kütüphaneler peptid benzeşme reaktifler 1,2,3,4,5için uygun bir kaynak görüntü, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Benzer şekilde fajının için 25,26 görüntülemek ve Maya görüntülemek 27,28, peptidler hücre yüzeyinde sunulur ve biyotik ve abiyotik hedefleri, bu etkileşimler ile bağlamak kullanılabilir peptid omurga ve benzersiz özellikler amino asit yan-Ketten 29tarafından tahrik. Feyc ekran, aksine bakteri kendilerini kendi kendini kopyalayan ve ilişkili fajının elüsyon ve hücre bulaşmalara olmadan görüntülemek için gerekli tüm genetik materyal içeren. Maya display aksine, bakteriyel görüntü hızlı (yaklaşık 20 dk 30) iki katına zaman Escherichiacoli nedeniyle daha hızlı olur. Elde edilen peptid benzeşme reaktifler üretilen hücre platformları 16,17,26 algılama çeşitli kullanım için kapalı ve görüntülendiğinde yaşam malzemeleri üzerinde- 2 hücre olarak kullanmak için potansiyel var , 31 , 32. belirli hedefleri tanınması için monoklonal antikorlar ile karşılaştırıldığında çok daha küçük ve daha esnek peptidler ve peptid görüntü kitaplıkları kolayca sistein 33 gibi belirli amino asitleri önlemek için DNA düzeyinde manipüle . Peptidler giderek tedavi 34,35,36 ve nerede antikorlar genellikle bulma, tekrarlanabilir sentetik (kapalı hücreli kolaylığı nedeniyle kullanılan diğer uygulamalar için istismar değildir ) üretim ve yüksek sıcaklık ya da uzun süreli depolama soğutma 37,38olmadan maruz kaldıktan sonra bile işlevsel bir reaktif sağlayarak aşırı ortamlarda performansı üstün bakım. Soğuk zincir reaktifler depolamak için üstesinden gelmek için Savunma Bakanlığı’nın, örneğin, hangi içinde en uçtaki çevre işletmek gerekir özel ilgi yeteneğidir. Termal kararlılık nedenle seçilen hedefleri bu el yazması örnek olarak verilen tanıma benzeşme reaktifler için arzu edilen bir özellik oldu.

Son zamanlarda, biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları haline gelmiştir bile daha basit ve güvenilir yöntemler 9,14,39(Mac veya MCS) sıralama yarı otomatik manyetik aktif hücre kullanımı ile. Platformları dahil ticari olarak mevcut farklı avantajları ile sıralama otomatik manyetik aktif hücre (autoMACS veya autoMCS) enstrüman sıralama bu yöntemler için biyolojik hedefler birkaç benzer kullanarak gösterilmiştir (tablo bkz: malzemeler) 1,14,15 ve örnek bir tek kullanımlık kartuş 7,9 veya çip 39, değerli bir belirtimi için içine almanız daha özel cihazlar kullanın organizmalar veya seviye 2 (BSL-2) veya daha yüksek7toksinler. Bu yarı otomatik yöntemler peptidler materyalleri manyetik veya manyetik bir boncuk üzerine ve (gibi anaerobik bakteriler) farklı organizmalar ile kullanmak için izin verirseniz kaplı olması yeteneği varsa abiyotik malzeme bağlamak mümkün sıralamak için uzun olabilir sıralama ve büyüme koşullar değişmiş. Bakteriyel görüntü kitaplıkları sıralamanın yanı sıra, burada kullanılan ticari autoMCS enstrüman da kısmen insan tek-zinciri antikor parçaları tarafından daha fazla yalıtım takip Maya, yüzeyi görüntülenen keşfi ilk adımlar için kullanılmıştır Floresan aktif hücre sıralama (FACS) 40kullanarak. Zaman ve çaba ve daha sağlam ve tekrarlanabilir ortadan kaldırılması manyetik boncuklar ilişkisiz hücrelerden yıkama adımları, azaltılmış yanlış pozitif durumlar için önde gelen, daha az gerekli sıralama turu sırasında ve daha az sıralama yarı otomasyon için birincil avantajı azaldı karmaşık aşağı akış çözümlemesi 9,14. Ticari autoMCS enstrüman söz konusu olduğunda orada saflık öncelik, son numune hacmi en aza indirilmesi ve artan negatif (tükenmesi), önceden sıralama gibi farklı uygulamalar için en uygun olabilir birden çok önceden yüklenmiş programları veya duyarlı bir yalıtım nadir hücreleri 41azalan.

Bu eser metodoloji biopanning için piyasada bulunan autoMCS enstrüman kullanarak bir bakteriyel görüntü kitaplığı göstermek ve analiz etme ve elde edilen havuzun içinde adayların en aza indirerek uygulanan düşünce süreci açıklamak için odaklanmıştır sipariş uzantısı diğer uygulamalara kolaylaştırmak için. Burada kullanılan görüntü kitaplığı (malzemelerin tabloya bakın) 12,13 içeren yaklaşık 109– 1011 benzersiz 15-mer peptidler bakteriyel dış membran protein OmpX değiştirilmiş bir versiyonu ile görüntülenen içinde bir Kısıtlamasız doğa sentetik üretilen çözüm ücretsiz peptid temsilcisi olması bekleniyor hücre yüzeyi. Bu protein iskele Ayrıca pozitif kontrol P2X peptid ifade üzerinden bağlayıcı YPet Mona için izleme için C-terminus adlı içerir. Ancak, bazı küçük değişiklikler gerekli olabilir ama uygun çeşitlilik ve istenen belirli uygulama için gerekli diğer özellikleri satın alınan veya yeni bir kitaplıkla aynı şekilde bu biopanning yordamı ile çalışmalıdır. Bu biopanning Protokolü’nün bir şematik Resim 1‘ de gösterilmiştir. Ayrıca, protokol adapte olabilir diğer manyetik sıralama platformları ve sıralama diğer stratejileri otomatik. El ile manyetik bir benchtop mıknatıs ile sıralama başarıyla, daha karmaşık ve zaman alıcı aşağı akım analizi nedeniyle gerekli yanlış pozitif 14artmış da olsa kanıtlanmıştır ve yine de bir alternatif seçenek sağlar autoMCS adımları otomatik manyetik hücre aygıt sıralama yok Eğer mevcuttur.

Protocol

1. Biopanning bakteriyel ekran kitaplıklarını kullanma autoMCS Not: Bu autoMCS tabanlı sıralama iletişim kuralı yukarıda açıklanan 14oldu ve bir daha kapsamlı “genişletilmiş iletişim kuralı için yeni kullanıcıları” potansiyel bir açıklama da dahil olmak üzere daha fazla ayrıntı için bu el yazması için ek materyalleri mevcuttur değişiklikler. Bir autoMCS aygıt sıralamak için kullanılabilir değilse, bkz: 14iş ek protokolü üzerinden Sarkes ve ark. Protokolü sıralama bir el de içinde açıklandığı bu yana 2015. Burada sağlanan daha fazla autoMCS iletişim kuralı için geliştirilmiş özgüllük 1,15ek negatif sıralama adımları içerecek şekilde adapte. Bu biopanning Protokolü’nün bir şematik Resim 1′ de gösterilmiştir. Negatif bağlayıcı ile manyetik boncuklar Cross-React olasılığı kaldırmak için sıralama 500 Luria suyu Miller (LB) içeren mL antibiyotik yaklaşık 1 x 10 ile11hücreler farklı bir bakteriyel görüntüler sıralama kitaplığı uygun aşılamak (malzemelerin tabloya bakın).Not: kullanılan bakteriyel ekran peptid Kütüphane burada yaklaşık 10 içerir (malzemelerin tabloya bakın)9- 1011benzersiz üyeleri 8,12 ve 25 µg/mL kloramfenikol (LB Cm25) içeren LB büyüyor. Bu iletişim kuralı kalan bu kitaplığı kullanılır kabul eder. Kültür 0,5 OD600 ulaşıncaya kadar 225 RPM’de sallayarak ile 37 ° C’de kuluçkaya – 0.55. 37 ° C’de 45 dk için 225 RPM’de sallayarak bir %4 hisse senedi 1: 100, sulandrarak peptid ifade %0,04 w/v L-arabinoz ile teşvik Yer kültür buzda indüklenen. Yaklaşık 2 x 1011 hücreleri vasıl 6000 x g 4 ° C’de 20 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldır ve yavaşça dönen tarafından 1.5 mL PBS hücrelerde resuspend.Not: 1.0 OD600 E. coliiçin 1 x 109 hücre/mL yaklaşık olarak eşittir.Not: Bu değil girdap mı hücreleri parçalayıcı; el ile veya kısaca ≤ sallayarak 225 RPM, 4 ° c resuspend Hücreleri microcentrifuge tüpler ve 6.000 x g 5 dk RT az ya da 4 ° c için spin transfer Süpernatant kaldırın. 1 mL tamponlanmış fosfat salin (PBS) % 0.5 sığır serum albumin (BSA; içeren hücre Pelet resuspend PBS-B). Streptavidin kaplı boncuk (3 x 109 boncuk, malzemelerin tabloya bakınız) 300 µL 1 mL PBS-B ve santrifüj 5 dk az ≥5, 000 x g (RT) yıkayın. Tüp bir tezgah üst Manyetik Parçacık ayırıcısı olarak yerleştirin. Dikkatli bir şekilde süpernatant, pelet kaçınarak çıkarın. Boncuk cep artı yukarıda hazırlanan PBS-B karışımı resuspend. Buz üzerinde 45 dk. yer örnekleri için dönen bir platform üzerinde 4 ° C’de kuluçkaya. Sistemi başlatmak için autoMCS araç üzerinde açın. Hattı “Ayrılık” menüsünde ekranın altındaki “Şimdi yıkama” seçerek üreticisinin Çalıştır ve yıkama arabellekleri (malzemelerin tabloya bakın) kullanarak asal sonra “Durulama” ve “Çalıştır”. PBS-B, PBS-B yıkama tampon ve çalışan tampon kullanarak sonraki adımda sistemiyle Başbakan. Üst gezinti çubuğundan “Ayırma” menüsünü seçin ve “Şimdi yıkama” seçin. “Durulama” ve taze PBS-B. sistemiyle Başbakan için “Çalıştır” seçin Hücre ve boncuk karışımı 15 mL konik tüp kuluçka adımından aktarın. Bu tüp örnek yuvaya yerleştirin ve önceden soğutulmuş (4° C) raf pozitif ve negatif seçim Yuvaları 15 mL konik tüplerde boş (malzemelerin tabloya bakın). Raf enstrüman platformda yerleştirin. Rafta her örnek için bir ayırma program atamak (en çok 5 örnekleri sıralanacağı bir vadede). Bir “Durulama” adım her örnek arasında ve son örnekten sonra ekleyin. “Hücre ayrılık başlatmak için Çalıştır”‘ı seçin. Yeterli arabellek kullanılabilir olduğunu onaylamak için “Tamam” ı seçin.Not: “Posselds” ayrılık program de negatif sıralama için çalışır ve olumlu round 1 ve “Posseld” sıralama turu 2-4, sıralama için tercih edilir ama bu programların her ikisi de başarılı bir şekilde kullanılmıştır için tüm negatif ve pozitif sıralama 14 Tur ,15 diğer programlar kanıtlamak ve belirli bir uygulama için daha iyi (açıklandığı daha fazla tartışma). Program tamamlandıktan sonra rafa kaldırmak ve uygun kesir korumak. Burada, negatif sıralama için negatif kesirler (Boncuk olmayan hücreler içeren) korur. Buza koyun. Negatif sıralama kesir bütünüyle LB Cm 0,2 w/v D-glukoz ile 1 L aşılamak için kullanın. 225 RPM’de sallayarak 37 ° C’de gecede büyümek. AutoMCS enstrüman açmadan önce çalışma ve yıkama arabellekleri üreticinin Çalıştır ve yıkama arabellekleri (malzemelerin tabloya bakın) olarak değiştirin. “Se甪imdi yıka”, sonra durulama” ve “Çalıştır”. Ne zaman tamamlanmak, dekontaminasyon hattı % 70 etanol olduğundan emin olun o zaman ekranın sağ üst köşede “güç simgesi” tuşuna basın ve “Evet” i seçin. Sistem kapatma işlemi tamamlandığında (şişe mor olacak), makineyi. Ertesi gün, gecede kültür dondurucu stokları yaklaşık 1 x 10 ile11hücreleri şişe başına LB içinde % 15 gliserol ile yapmak için kullanın. Buna ek olarak, ya da alternatif olarak, bir sonraki adımda bu kültür kullanın: ek negatif sıralama (Bölüm 1.2) veya pozitif (bölümünde 1,3) sıralama ilk turu. Negatif bağlayıcı faiz hedefler ile Cross-React olasılığı kaldırmak için sıralamaNot: Eğer daha fazla negatif sıralama gerekli veya istenen bölüm 1.2 atlanabilir. Bu durumda, 1.3 bölümüne geçin. Herhangi bir istenmeyen hedeflerine artık bağlama 2 bölümde olduğu gibi FACS tarafından değerlendirildi: sıralama mermi FACS analizi. Potansiyeli de keşfedilen peptidler 1,15, bind ile benzer bir protein gibi bir belirli protein hedefe karşı negatif sıralama için büyüme ve indüksiyon 1.1.1 – 1.1.3, donmuş bir stokunun ile başlayan yineleyin Adım 1.1.15 veya adım (OD600 tahmin ve 1 x 1011 hücrelerle aşılamak için kullanarak) 1.1.12 gecede kültür kütüphane streptavidin tükenmiş. Hücreleri microcentrifuge tüpler ve 6.000 x g 5 dk RT az ya da 4 ° c için spin transfer Süpernatant kaldırın. Hücre Pelet 1 mL 600 nM biotinylated cross-reactive protein hedef içeren PBS resuspend. Dönen bir platform üzerinde 45 dk için 4 ° C’de kuluçkaya.Not: 600 nM olduğunu kaydetti bir yarar gözlem yapılırsa değiştirilebilir bir önerilen başlangıç konsantrasyonu,. Biotinylation protein hedef elde edilebilir ve quantified reaktifleri kullanılarak malzeme tabloda önerdi. Bu arada, 100 µL streptavidin kaplı boncuk (1 x 109 Boncuk) 1 ml PBS-B ve 5 min için santrifüj ≥ 5000 x g (RT) itibariyle de yıka. Tüp bir tezgah üst Manyetik Parçacık ayırıcı ve Pelet kaçınarak Kaldır süpernatant, dikkatli bir şekilde yerleştirin. 6.000 x g 5 min (RT veya 4 ° C) için de hedef bağlı hücreler santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 1 mL PBS-B. resuspend Yıkanmış hücre cross-reactive protein hedefe bağlı tüm birimdeki boncuk resuspend. 30 dk için dönen bir platform üzerinde 4 ° C’de kuluçkaya. Örnek buz ve adımları tamamlayın 1.1.7 – 1.1.15 uygun dondurucu stokları yapma negatif bir sıralama için üzerine koyun. Eğer tüm istenen negatif sıralama elde 1.3 olumlu sıralama için bölüm veya başka bir potansiyel cross-reactive protein karşı negatif sıralama için Bölüm 1.2 tekrar devam edin. Yuvarlak 1 pozitif sıralamaNot: yuvarlak 1 pozitif karşı belirli bir protein sıralama hedef belirli bir sıralama hedef karşı olumsuz bir sıralama benzer (1.2 bakın) boncuk içeren, pozitif kesir korunur hariç. 500 mL lb Cm25 yaklaşık 1 x 1011hücreler farklı bir bakteriyel görüntülemek bu streptavidin tükenmiş edilmiş ve gece (Kimden adım 1.1.12) veya (Kimden adım 1.1.15) dondurulmuş ve çözülmüş buz üzerinde yetiştirilen veya bu olmuştur sıralama kitaplığı aşılamak daha fazla bağlayıcı (Kimden adım 1.2.5), diğer cross-reactive protein hedeflere istediğiniz gibi tükenmiş. Kültür 0,5 OD600 ulaşıncaya kadar 225 RPM’de sallayarak ile 37 ° C’de kuluçkaya – 0.55. 37 ° C’de 45 dk için 225 RPM’de sallayarak bir %4 hisse senedi 1: 100, sulandrarak peptid ifade %0,04 w/v L-arabinoz ile teşvik Yer kültür buzda indüklenen. Yaklaşık 6.000 x g 4 ° C’de 20 dk için de 2 x 1011 hücreleri santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldır ve yavaşça dönen (el ile veya kısaca sallayarak ≤ 225 RPM, 4 ° C) 1,5 mL PBS hücrelerde resuspend. Hücreleri microcentrifuge tüpler ve 6.000 x g 5 dk RT az ya da 4 ° c için spin transfer Süpernatant kaldırın. Hücre Pelet 1 mL 600 nM biotinylated protein hedef ilgi içeren PBS resuspend. Dönen bir platform üzerinde 45 dk için 4 ° C’de kuluçkaya.Not: 600 nM olduğunu kaydetti bir yarar gözlem yapılırsa değiştirilebilir bir önerilen başlangıç konsantrasyonu,. Biotinylation protein hedef elde edilebilir ve quantified reaktifleri kullanılarak malzeme tabloda önerdi. Bu arada, 100 µL streptavidin kaplı boncuk (1 x 109 Boncuk) 1 ml PBS-B ve 5 min için santrifüj ≥ 5000 x g (RT) itibariyle de yıka. Tüp bir tezgah üst Manyetik Parçacık ayırıcısı olarak yerleştirin ve Pelet kaçınarak süpernatant, dikkatli bir şekilde çıkarın. Kuluçka hedef ile tamamlandığında, 6.000 x g 5 min (RT veya 4 ° C) herhangi bir ilişkisiz hedef protein kaldırmak için de hedef bağlı hücreler santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 1 mL PBS-B. resuspend Yıkanmış hücrelerin protein hedefe bağlı tüm birimdeki boncuk resuspend. 4 ° c 30 dk. yer buz üzerinde dönen bir platform üzerinde kuluçkaya. Sistemi başlatmak için autoMCS araç üzerinde açın. Ayrılık menüde ekranın altındaki “Şimdi yıkama” seçerek üreticisinin Çalıştır ve yıkama arabellekleri (malzemelerin tabloya bakın) kullanarak satırları asal sonra “Durulama” ve “Çalıştır”. PBS-B, PBS-B yıkama tampon ve çalışan tampon kullanarak sonraki adımda sistemiyle Başbakan. Ayrılık menünün üst gezinti çubuğundan seçin ve yıkama şimdi seçin. Durulama ve çalışma sistemi ile taze PBS-B. hazırlamak için seçin Kuluçka yukarıdaki hücre ve boncuk karışımı ek bir 500 µl PBS-b ile tüp durulama ve örnek ile yıkama havuzu bir 15 mL konik tüp, aktarın. Bu tüp örnek yuvaya yerleştirin ve önceden soğutulmuş (4° C) raf pozitif ve negatif seçim Yuvaları 15 mL konik tüplerde boş (malzemelerin tabloya bakın). Raf enstrüman platformda yerleştirin. Rafta her örnek için bir ayırma program atamak (en çok 5 örnekleri sıralanacağı bir vadede). Bir “Durulama” adım her örnek arasında ve son örnekten sonra ekleyin. “Hücre ayrılık başlatmak için Çalıştır”‘ı seçin. “OK” veya “yeterli arabellek kullanılabilir olduğunu doğrulamak için devam” seçin.Not: De negatif sıralamak için “Posselds” ayrılık program çalışır ve olumlu yuvarlak 1 ve “Posseld” sıralama turu 2-4, sıralama için tercih edilir ama bu programların her ikisi de başarılı bir şekilde kullanılmıştır için tüm negatif ve pozitif sıralama 14 Tur , 15 diğer programlar kanıtlamak ve belirli bir uygulama için daha iyi (açıklandığı daha fazla tartışma). Program tamamlandıktan sonra rafa kaldırmak ve uygun kesir korumak. Burada, olumlu sıralama için pozitif kesirler (hücreleri ve boncuk içeren) korur. Buza koyun. AutoMCS enstrüman açmadan önce çalışma ve yıkama arabellekleri üreticinin Çalıştır ve yıkama arabellekleri (malzemelerin tabloya bakın) olarak değiştirin. “Se甪imdi yıka”, sonra durulama” ve “Çalıştır”. Ne zaman tamamlanmak, dekontaminasyon hattı % 70 etanol olduğundan emin olun o zaman ekranın sağ üst köşede “güç simgesi” tuşuna basın ve “Evet” i seçin. Sistem kapatma işlemi tamamlandığında (şişe mor olacak), makineyi. Pozitif sıralama kesir bütünüyle LB Cm 0,2 w/v D-glukoz ile 1 L aşılamak için kullanın. 225 RPM’de sallayarak 37 ° C’de gecede büyümek. Ertesi gün, gecede kültür dondurucu hisse senetleri % 15 gliserol içeren LB yapmak kullanmak ve/veya pozitif bölümünde 1.4 yuvarlak 2 sıralama devam. Sonraki olumlu sıralama turuNot: genellikle yeterli 14,15üç sıralama tur olmasına rağmen genellikle, dört sıralama mermi, tavsiye edilir. Ne zaman sıralama durdurmak için tarafından yardımlı mermi sıralama FACS analizi 2 bölümünde açıklanan. Hedef ve manyetik boncuk birim konsantrasyonları her sonraki olumlu sıralama yuvarlak azaltın. Önceki sıralama turu (veya bu turda bir donmuş hücre hisse senedi), gecede kültür kullanarak aşılamak 5 mL LB Cm25 ile 100 µl hücreleri (1:50 seyreltme). Kültür 0,5 OD600 ulaşıncaya kadar 225 RPM’de sallayarak ile 37 ° C’de kuluçkaya – 0.55. Peptid ifade %0,04 w/v L-arabinoz, 37 ° C’de 45 dk için 225 RPM’de sallayarak ile teşvik Yer buz hücrelerdeyse indüklenen.Not: Bu indüklenen kültür de bağlama benzeşme ve özgüllük bu kökenli sıralama turu için 2 aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi değerlendirmek için kullanılabilir. 6.000 x g 5 dk RT az ya da 4 ° c için 1 x 108 hücreleri santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırmak ve 50 µL PBS biotinylated protein hedef sıralama önceki turu için kullanılan ilgi yarım konsantrasyon içeren hücre Pelet resuspend (Bu nedenle 300 nM yuvarlak 2, 150 nM yuvarlak 3 ve 75 nM için yuvarlak 4 bizim önerilen başlangıç noktası). 45 dk buz üzerinde (veya 4 ° C’de dönen bir platform) için kuluçkaya. Bu arada, boncuk streptavidin kaplı yıkayın (round 2 15 µL için 8 µL için tur 4 yuvarlak için 3 ve 4 µL) 1 mL PBS-B ve santrifüj ≥ 5000 x g (RT) at, 5 min için. Tüp bir tezgah üst Manyetik Parçacık ayırıcı ve Pelet kaçınarak Kaldır süpernatant, dikkatli bir şekilde yerleştirin. Boncuk 50 µL resuspend PBS-d. Adım 1.4.3, hedef ile 45 dk kuluçka santrifüj kapasitesi sonra hücreleri 6.000 x g 5 dk RT az veya 4° C de, süpernatant kaldırın ve boncuk 1.4.4 yıkanmış 50 µL hücrelerde resuspend. Buz ve adımları tamamlayın 1.3.7 – 1.3.13 olumlu bir sıralama için örnek olsun. LB Cm 0,2 w/v D-glukoz ile tüm olumlu, boncuk içeren kesir sıralama ile takıma 5 mL kültürü aşılamak. Ertesi gün, gecede kültür dondurucu hisse senetleri % 15 gliserol içeren LB yapmak ve/veya sonraki olumlu yuvarlak sıralamaya devam kullanmak, adım 1.4.1 dönen.Not: 1.4.2 indüklenen kültüründen bağlama benzeşme ve özgüllük değerlendirmek için kullanarak aşağıda 2 bölümünde açıklandığı gibi sıralama duracağını belirlemek yardımcı olabilir. Üst üste iki sıralama turu benzer bağlama ilgi gösterme veya gösterir daha sonra bir yuvarlak hedef ilgi için bağlama ilgi azaldı, bu bir arzu koyun sıralama durdurmak için. Son turdan sonra adım 1.4.1 dönüş ama 1.4.2 kes. 2. FACS mermi sıralama analizi Adım 1.4.2 indüklenen hücrelerden her sıralama yuvarlak veya aynı kültürler için kullanarak ekleyin 5 indüklenen µL hücrelerin her biri 25 µL çözümleri değerlendirme bağlama için hazırlanan (Ayrıca bkz: malzemelerin tablosu): PBS yalnız; PBS ile 150 nM YPet Mona (YPet 12,13; ifade için olumlu denetim), varsa; Amin-reaktif boya ile emisyon/uyarma 493 nm⁄518 nm (hedef-488); gibi bir floresan boya 900 nM protein hedef Birleşik 900 nM cross-reactive protein hedefler aynı floresan boya (Cross-Reactive Protein-488); ile etiketli negatif sıralamak için kullanılan ve 900 nM streptavidin-R-phycoerythrin (SAPE). 45 dk için buz üzerinde kuluçkaya.Not: Eğer doğrudan adımından 1.4.2, bu adım-ecek her zaman devam bitmiş aşağı seçili Kütüphane gecede büyüdü beri biopanning bu tur için tamamlandıktan sonra gün sonra subcultured ve ertesi gün indüklenen. Yetiştirilen ve benzer şekilde dondurulmuş sıralama yuvarlak hisse senetleri indüklenen kültürler de kullanılabilir; Bu durumda, tüm turlarda test ve tek bir deneyde karşılaştırıldığında. Santrifüj hücreleri 6.000 x g 5 dk RT az veya 4° c de Süpernatant çıkarın ve örnekleri buza saklayın.Not: tüm örneklerini analiz için hazır olana hücre topakları buz üzerinde depolanabilir. FACS araç üzerinde açmak, yazılım, başlangıç sistem açın ve araç üreticisinin yönergeleri 43,44takip kalibre. FACS yazılımından, tıkırtı üstünde “idareci” ve istediğiniz klasörü tıklatın veya “Yeni klasör” oluşturun Tıklatın “Üzerinde yeni bir deneme” üst simge ekranın yaptı. Sağ “deneme yeniden adlandırmak için” simgesini tıklatın. Bu deney içinde “Küresel çalışma sayfalarında”‘ı tıklatın. “Nokta çıkart” simgesine tıklayın, ardından genel çalışma sayfası elektronik tablo üzerinde bu scatterplot oluşturmak için tıklatın. Nokta çizim grafik üzerinde tıklatın ve sonra seçin “Müfettiş” simgesi üst ekranın bıraktı ve biexponential görüntülenecek eksenleri açık pencerede “Y ekseni” ve “X ekseni” yanındaki kutuları seçerek ayarlayın. X tıklayarak biexponential görüntü penceresini kapatın. Oluşturma bir “yeni üst simgesini tıklatarak tüp” sol ekran ve numune uygun bilgilerle “küresel çalışma sayfası” altında numune simgesini sağ tıklayıp “rename” seçerek yeniden adlandırın. Örnek (+) tıklatarak genişletin işareti, daha sonra tüp simgesine çift tıklayın-doğru tıkırtı üstünde o ve tekrar seçin “örnek açıklamak için rename”. Bu nokta çizim grafik varsayılan SSC-A vs ile kullanmak FSC-A çift tıklayarak o tüp veya yanındaki oku seçerek PBS yalnız bir negatif kontrol örneği çalıştırmak için. Sadece örnek çalıştırmadan önce hücre Pelet 500 µL buz soğuk FACS arabellek ve transfer örnek bir FACS çalıştıran içinde resuspend (malzemelerin tabloya bakın) tüp, iyi pipetting ve tüp flicking karıştırma. Resuspended hücreleri araç örnek enjeksiyon metroyla (SIT) yerleştirin. Basın “elde veri” 30.000-50.000 “olaylar için ekrana” ve ‘Olaylar için kayıt”10.000,’ile akışı düşük oranda (başlatmak için; gerekirse artırmak) ve”Seçili floş OTURUP”.Not: Uygun hızı (düşük, orta veya yüksek) hangi olaylar/s yaklaşık 200 ile 2000 yılları arasında sayısıdır hızıdır.  Bu Aralık için tüm adımları kullanın. Edinme, üzerinde “Eşik” sekmesini seçerek gerekirse photomultiplier tüp (PMT) gerilim eşik ayarlayın ve değişmek belgili tanımlık “değer”. Öyle ki PBS yalnız negatif kontrol hücreleri, biraz Merkezi düşmek gerilim ön ve yan dağılım (FSC ve SSC) için ayarlayın.Not: (SSC gibi) ek parametreler “Eşik” sekmesinde “ekleyin” ikonunu kullanarak eklenebilir. Normal olarak, devresel_ödeme gerilimleri yaklaşık 700 V 1000V SSC ve FSC için de E. coliiçin çalışır. Eğer örnek düzgün okuma, 200-2000 olaylar/s görüntülemek ve “Kayıt verileri” tuşuna basın için akış hızını ayarlayın. Ne zaman tamamlanmak kayıt, tüp SIT kaldırmak ve yerine buz üzerinde.  “Çokgen Gate” simge seçin ve bir kapı hücre nüfusun çoğunluğu çevresinde scatterplot çizmek için fareyi kullanın. Nokta arsa üzerinde sağ tıklayın ve “Nüfus hiyerarşiyi göstermek” seçin. Bu “P1” kapı bir ebeveyn olarak kullanmak “P1” nüfus hiyerarşi içinde tıklatın. 2.5. adımda takip yeni bir nokta Çizim oluşturma. Her eksen sağ tıklatın ve y ekseni FITC-a ve x ekseni FSC-a ana bilgisayarına değiştirmek Kapı negatif kontrol (PBS yalnız) nüfus üst ve sol tarafında etrafında mümkün olduğunca sıkı kapaklı “çokgen kapısı” simgesini kullanarak.Not: Çift nüfus hiyerarşi P1 kapısı P2 kapısı’nın bir üst olduğundan emin olmak için kontrol edin. Yoksa, o-ecek gözükmek ile uyumlu P1 kapısı ve “Tüm olayları” üst olacak; kapı silin ve 2.10 adım takip yeniden oluşturun. “P2” nüfus hiyerarşisinde seçin, sağ tıklayın ve “kapı ters çevir’i” seçin. P2 kapaklı nokta arsa üzerinde sağ tıklayın ve “Göstermek nüfus” seçin. Nüfus “P2” ve “Değil P2” göstermek için seçin (nüfusun % 1’den az kapının dışında sonbahar sahiptir). Nokta komplo P2 kapısı ile doğru tıkırtı ve seçme “İstatistik görünüm oluştur”. İstatistikleri görüntüleme penceresi sağ tıklatıp “İstatistik Görünümü Düzenle” i seçin. “Nüfus” sekmesini tıklatın ve eklemek veya kaldırmak istediğiniz kadar üst nüfus, P1 de dahil olmak üzere nüfus (P2 ve değil P2 zaten gösterilmesi). “İstatistik” sekmesini tıklayın ve “FITC-A ortanca” ve diğer istatistik ilgi ekleyin. OK tuşlarına basarak pencereyi kapatın. PE-A vs FSC için benzer bir nokta çizim grafik oluşturmak-A ve PBS tek başına örnek kullanarak kapı (önceki araziler-çoğaltılamaz ve değişmiş). Bu elektronik tablo tüm örnekleri (her fluorophore etiketli hedef ile inkübe negatif kontrol hücreleri de dahil olmak üzere) her biri için yaklaşık 10,000 olayları kayıt bu şekilde çalıştırmak için kullanın.Not: Hücreleri hedef-488 protein, kontrolü, vb bağlayıcı protein için vardır ve “Değil (burada X Bu grafik için geçişli nüfus sayısıdır) PX” değerinden % bağlı kaydedilmesi gereken olumlu YPet kuluçka sonra kapının dışında kalan. SAPE bir negatif kontrol kullanırken, PE-A vs FSC-A arsa kullanın. Bu ötesinde % bağlama, bağlama ölçüde nispi göstermek için bilgi verir ve aykırı 45varlığında daha sağlam gibi P1 medyan floresan yoğunluğu (MFI) ayrıca kaydedilmelidir. Medyan floresan yoğunluğu normalleştirilmiş (nMFI) her peptid MFI iskele tek olumsuz denetim (ile N-terminal peptid) veya faiz, hedef bağlanmaz bir peptit dizisi içeren bir klon MFI tarafından bölerek kuluçka sonra olabilir aynı fluorophore 14′ e Birleşik aynı hedefle. Bu negatif kontrol hücreler kullanılamıyorsa, aynı hedef ile inkübe ve ile aynı fluorophore etiketli uninduced hücreleri normalleştirme için de kullanılabilir. 3. dizi analizi potansiyel adaylar ve değerlendirme benzeşme bağlama Peptit dizisi belirlenmesi Seçin ve sıra onlarca veya yüzlerce bakteri kolonileri biopanning son tur üzerinden (genellikle yeterli 14mermi 3 ve/veya 4 vardır). Sıra analiz etmek için özel olarak geliştirdiğimiz (kod için “Alt eCPX_Sequencing” destekleyici bilgilere bakın) makro dosyası kullanma veri analiz 15mer bakteriyel görüntü kitaplığı tabloda listelenen biopanning kaynaklandığı dizileri malzemeler. Malzeme veya tercih edilen diğer uyumlu yazılımlar tablosunda listelenen elektronik tablo yazılımı kullanın.Not: Araç online bu da DNA dizi analizi 47yılında yardımcı olabilir mevcuttur. Tercih edilen farklı bir kurulan yöntem dizi analizi için kullanın ve 3.1.3 adıma atlayın. Download sırası dosyalarını (.seq dosyaları, metin belgeleri da iş) set ve onları yeni bir klasöre ayıklayın. Gerekirse, taşımak veya klasör geliştirilmiş hız için bilgisayarın sabit disk (aksine bir ağ klasörü) kopyalayın. Yeni bir elektronik tablo penceresini açın. Bu iletileri açılır makroları etkinleştirmek ve tüm özelliklerini etkinleştirmek emin olun.Not: 3-6 aşağıdaki adımları yalnızca makro ilk kullanıldığında tamamlanmak üzere gereksiniminiz olur. Daha sonraki analiz için sadece “7 adımda başlayarak Makro Çalıştır”. Makro “alt eCPX_Sequencing” dosyasında bulunan tüm içeriğini kopyalayın.Not: Geçerli sürüm dizileri malzemeleri tablosunda listelenen 15-mer kitaplığı için kanat ile ayarlanır ve amino asitler aralarında çevirecek. Ek dizileri 5′ A sütununda ve 3′ 10 sıraları her makroyu çalıştırmadan önce kadar elektronik tablonun sütun B serilerinde kanat serilerinde kanat kopyalayarak girilmiş. Boş elektronik tablo dosyasındaki “Görünüm” sekmesini seçin ve ardından çift tıklayın “Makroları.” Personal.xlb klasörü seçin. Bu kullanılamıyorsa, önce bu görünüm yapmak için bir makro kaydedin. “Oluştur” u tıklayın veya “, ne bağlı olarak adım atın” vurgulanacak. Tüm makro modüle yapıştırın. Kayıt tıklatın simgesini veya git, dosya kaydetme. Çıkış modülü. Bir pencere açılır, Tamam tuşuna basın. Makroyu çalıştırın: desired.seq dosyaların nerede konumlandırıldığını klasöre gidin. Bar yanında simgesi klasörün üst klasörü konumunu görmek için tıklayın. Bunu kopyalayın. Yeni elektronik tablo penceresine dönün. Görünüm sekmesini seçin ve sonra makroları çift tıklatın. “ECPX_Sequencing” seçin ve “Çalıştır” ı tıklatın Adım 7 açılır, hamur içinde kopyalanan dosya konumu kutusunda ve vurmak girmek. Makro dizileri ile gidiş ve bunların çeşitli sayfalardaki tablolara düzenlenmesi başlayacaktır. Eğer o-ecek var olmak izleme dosyaların hataları için denetleyin ve el ile (dizileri “X” içeren değil tercüme edilebilir ya da) düzeltmeleri yapmak için gerekli belirlemek için “Özet Tablo” sayfasını kullanın.Not: “Özet Tablo” çeviri bir sıralama hatası engelledi sürece (A’dan Z’ye), amino asit dizisine göre sıralanmış çevrilmiş peptid sıraları görüntüler. Bir “X” belirlenemedi bireysel bir amino asit gösterir. Kez düzenlenen, dizileri çevrilir ve herhangi bir sıralama hata düzeltildi, sıralanmış peptid sıralı liste herhangi bir yinelenen dizileri “Özet Tablo” sayfasını kontrol edin. Gecede kültür 225 RPM’de sallayarak 37 ° C’de 5 mL LB Cm25 (tekrarlar ve/veya peptidler en azından fark eğilimleri ile dahil) ilgi sıralı colonies için büyümek ve dondurucu stokları ertesi gün adım olduğu gibi % 15 gliserol içeren LB kaydedin 1.4.7. dizileri benzeşme bağlama için tekrarlayan olan peptidler test ve özgüllük içinde açıklanan FACS yöntemleri kullanarak bölüm 3.3 ve tercih edilen hizalama kullanarak dizileri hizalamak için sıralı liste (tüm liste ve sadece tekrarlar) FASTA biçimini kullanın ve analiz programları, Bölüm 3.2 olduğu gibi. Clustal Omega, Kalign ve benzer programlar kullanarak dizi hizalaması FASTA elektronik tablo makro biçiminden FASTA dizileri kopyalamak veya aksi takdirde (örneğin, bu adım 3.1.3) hizalanmasını dizilerinden FASTA dosyaların bir listesini oluşturun.Not: A sütununda göre sayısal sırada FASTA dosyaları içeren “Seq #” sütun B onları “AA serisinden” “Özet Tablo” sayfası göre sıralanmış görüntüler. Amino asit dizisi tarafından sıralanmış peptid dizileri listesi boş vektör (olarak “# boş”) ve hangi ne (“# değer”) 5′ veya 3′ arama ölçütü bulundu bu dizileri gibi üst kullanılamaz sıraları görüntüler. Kolay güncelleme veya bu dizileri çözümlemesi kaldırılması için bu özellik sağlar. Clustal Omega48 veya Kalign49 yazılım web sitesi 50,51’ e giderek açın veya dizi hizalaması için tercih edilen diğer yazılımları kullanın. Kopyalama ve FASTA sıralı liste Yapıştır ve içine belgili tanımlık kutu “dizileri desteklenen herhangi bir biçimde” aşağıda giriş. “Gap açık ceza” 30 “daha fazla seçenek” (Bu Clustal Omega mümkün değil) Kalign altında değiştirmek, ancak aksi takdirde “Gönder”‘ı tıklatmadan önce varsayılan ayarları koruyun. Dizi hizalaması hizalamayı yukarıda “sonuç Özet” sekmesini seçerek ve sonra “Jalview” simgesini tıklatarak Jalview 52,53 yazılım doğrudan içinde Clustal Omega ve Kalign online yazılım kullanarak analiz.Not: tercih edilen veya alternatif programlar tarafından oluşturulan sıra hizalamaları çözümlenmesi için ayrı ayrı 54 yazılımı indirmeniz ve Kopyala Yapıştır hizalama “Dosya”, “Giriş hizalama”, tıklatarak açtığınız analiz pencere içine ve ” metin kutusu “. Bu kolayca giriş dizisi uyum konusunda bir fikir birliği sıra olup olmadığını belirlemek için bir araç sağlar. Bağlama benzeşme ve özgüllük FACS kullanarak karşılaştırma 5 mL LB Cm 0,2 w/v D-glukoz ile ilgi her bireysel izole (Kimden adım 3.1.4 ve/veya bölüm 3.2, vbdaha fazla dizi analizi dan ilgi kolonileri) ve uygun bir negatif denetim (ekran ile desteklenmiş aşılamak Sadece iskele veya hedef, adım 2,13 için Not açıklandığı gibi bağlanmaz bir peptid). 225 RPM’de sallayarak 37 ° C’de gecede büyümek. Gecede kültür 3 mL LB Cm25 60 µl hücrelerle aşılamak için kullanın (1:50 seyreltme). Kültür 0,5 OD600 ulaşıncaya kadar 225 RPM’de sallayarak ile 37 ° C’de kuluçkaya – 0.55. Peptid ifade %0,04 w/v L-arabinoz ile neden artı 2 mM EDTA (için kolaylaştırma peptid ekran 42), 37 ° C’de 45 dk için 225 RPM’de sallayarak Yer kültürler buzda indüklenen. Her izole etmek için 25 µL PBS yalnız veya PBS içeren 5 µL hücreleri ekleme: 150 nM YPet 12,13 (ifade için pozitif kontrolü), varsa; 250 nM hedef-488; 250 nM Cross-Reactive Protein(s)-488; ve 250 nM SAPE (2.1 daha fazla ayrıntı için bakınız). 45 dk için buz üzerinde kuluçkaya. Santrifüj hücreleri 6.000 x g 5 dk RT az veya 4° c de Dikkatli bir şekilde süpernatant sıvı Pelet ters taraftan çekerek çıkarın. Hücre topakları tüm örnekleri ve analiz için hazır kadar buz üstünde depolar. Pipetting ve sadece okuma Akış Sitometresi kullanarak önce tüp flicking tarafından iyi karıştırma arabellek, çalışan 500 µL buz soğuk FACS her hücre Pelet resuspend (malzemelerin tabloya bakın).Not: Bkz: adım 2,13 bağlama benzeşme ve özgüllük karşılaştırmak için başka bir açıklama perdeleme ve nMFI hesaplanması için notlar. Sigara-bağlayıcı ya da non-spesifik bağlayıcı artık daha fazla analiz kaldırılabilir ve en yüksek afinite bağlayıcı Bölüm 3.2 daha fazla sıralı ilk cevapsız eğilimleri aramak için aşağıdaki dizi hizalaması tarafından yeniden değerlendirilmek nüfus. Bölümler 3.2 ve 3.3 yeni eğilimleri gerektiği gibi tekrar edilebilir ve fikir birliği dizileri belirtilmiştir. Eğilimleri değil görülürse bu analiz daha fazla rasgele dizileri içerebilir.

Representative Results

Otomatik manyetik aktif hücre (autoMCS) el ile manyetik hücre sıralama yerine sıralama kullanımıyla, yanlış negatif adaylar bakteriyel görüntü kitaplıkları 9,14biopanning sırasında önemli ölçüde azaltılır. Negatif sıralama adımları olmak de eklenebilir non-spesifik bağlayıcı faiz hedefe azaltmak için gerektiği gibi ve bu en azından kendilerini ön boncuk manyetik karşı olumsuz bir tür eklemek için önerilmektedir. Şekil 2ve ek negatif seçimden önce gösterildiği gibi koruyucu antijen (PA) bağlayıcılar için kütüphane biopanning bakteriyel seçilmiş dört tur görüntülemeden önce bu negatif seçim manyetik Boncuklar karşı tamamlandı rivax ve pozitif seçim için abrax, şekil 3′ te gösterilen dört tur karşı. Streptavidin için bağlama peptidler istenmeyen yalıtım ve bir husustur FACS ile kullanarak izlenir Yani burada kullanılan boncuklar streptavidin yakalama biotinylated proteinlerin için Birleşik streptavidin Birleşik Phycoerythrin (şekil 3 için , SAPE). En azından streptavidin bağlama için umut verici herhangi bir bireysel aday bağlama hedef protein değerlendirilirken test edilmelidir. Yüzde bağlama ve nMFI SAPE için düşük değerler tüm sıralama mermi olması gerekir. Streptavidin bağlama düzeyini biraz sıralama her yuvarlak şekil 3′ te, nüfus art arda sıralama her turdan sonra streptavidin kaplı manyetik boncuklar maruz kalmaktadır çünkü oluştu olarak artırabilir. Arka plan streptavidin bağlama düzeyini aşağı akım analizi için sorunlu hale gelirse, daha fazla negatif manyetik Boncuklar karşı sıralama içinde streptavidin bağlama nüfus artış olumlu sıralama turun ardından yerine olabilir sipariş yanlış pozitif aşağı akım tarama azaltmak için. Proteinler veya malzeme hazır olduğunda hangi özellikle peptid aşağı akım kullanımı belirli bir uygulama için ile engelleyebilir veya hangi hedef nedeniyle yapısal ve/veya sıra benzerlik benzeşme Kimyasalları ile cross-react beklenir, daha fazla negatif sıralama karşı protein veya malzeme tavsiye edilir. Yalıtım abrax bağlama peptidler, yapısal benzerlik ve bu iki protein 1,15sıra homoloji nedeniyle önce rivax karşı negatif sıralama bir örnektir. Yine, cross-reactive negatif için kullanılan proteinler bağlama adımları sıralama FACS (şekil 3Rivax-488) kullanarak mermi sıralama analizi sırasında izlenebilir. En iyi senaryo yüzde bağlama ve nMFI bu örnekte olduğu gibi düşüktür. Ne zaman elde edilebilir, P2X peptid temsilcisi sonuçları buraya, kullanılan bakteriyel görüntü Kitaplığı tarafından üretilen ekran iskele, C-terminus, gibi bir sabit olumlu denetim peptid benzeşme FACS tahlil bağlama eksikliği olup olmadığını belirlemenize yardımcı olabilir ekranın ifade eksikliği nedeniyle kendisi, hedef için peptide(s) ilgi eksikliği yerine İskele yapısı. Şekil 2 ‘ deki ve şekil 3, YPet Mona bu P2X bağlama peptid izlenir ve sıralama ilk turda iskele kötü hızlı gösterir. Bu N-terminal peptidler iskele kendisi değil üretildi anlamına gelir rasgele kitaplığında stop kodon yüksek frekans nedeniyle ağırlıklı olarak olasıdır. Diğer efektler ek olarak, peptidler E. coli, beklenmeyen toksik etkileri ile varlığı gibi katkıda bulunabilir veya başka bir nedenle (örneğin, bakteriyel genom mutasyonların) büyüme veya peptid görüntü oranları azalmıştır. EDTA ilavesi indüksiyon sırasında 42sıralama erken bu tur sırasında ifade artırabilir, ancak henüz test edilmemiştir. Her biopanning YPet Mona için bağlama nüfus önemli ölçüde yuvarlak 3 tarafından geliştirildi. Resim 2 Resim 3ile karşılaştırıldığında, bu da ifade düzey (olduğu gibi şekil 3YPet Mona), 45 dk yerine indüksiyon zaman ( Şekil 2YPet Mona) olduğu gibi 90 dk artırarak geliştirilebilir belirgindir 45 dk genellikle yeterli olsa da. Böylece değerleri 1.0 yakınındaki ifade seviyesi kabul edilebilir ise tipik nMFI YPet Mona için negatif kontrol hücreleri, YPet Mona bağlama düzeyini normalleştirilmiş unutmayın. YPet Mona MFI PBS yalnız MFI için aynı örnekten normalleştirme de göreceli ifade düzeyleri karşılaştırmak için geçerli bir yol, ama çok daha yüksek değerler verir ( Şekil 2 karşılaştırmak ve şekil 3 ile Sarkes neden olur ve ark. 2015 15). Zenginleştirme ilgi belirli hedef için bağlama peptidler kitaplığının genellikle üç olumlu sıralama tur içinde elde, ama sıralama dördüncü turda devam olabilir yararlı, Şekil 2 ‘ de gösterildiği gibi ve şekil 3 . Burada, yüzde bağlı hücreler ve nMFI devam etmek için hem örnek hedefler, PA ve abrax, hangi Şekil 2 kırmızı kutulu 4 yuvarlak yuvarlak 3 artırmak ve şekil 3, anılan sıraya göre. En yüksek afinite peptid dizileri zaten round 3 mevcut olabilir ama yuvarlak 4 de, hangi potansiyel adaylar 14aşağı seçim içinde AIDS daha da zenginleştirmek muhtemeldir. Analiz yuvarlak 4 sıralarının yinelenen dizileri ortaya çıkarmak eğilimindedir, ve bunlar serilerini yinelenen benzeşme ve özgüllük analizi ve fikir birliği sıra belirlenmesi için mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Bu el yazması ek olarak sağlanan eCPX_Sequencing makro şekil 4′ te gösterildiği gibi ilk bu analizi, verimlilik düzeyini artırmak için yardımcı olur. Bir klasör .seq veya metin dosyaları, seçilen 5′ ve 3’ dizileri arasında yatıyor DNA dizisi ile başlayan tercüme, amino asit dizisi tarafından düzenlenen ve her peptid bireysel amino asit kalıntılarında sayısı için analiz. İzole peptid dizileri, sıralı listesini kolayca tekrar ve hangi frekansta hangi sıralarını belirlemek için şekil 4Özet Tablo sayfa ekranda gösterildiği gibi kullanılabilir. Yinelenen dizileri içeren bu elektronik tablodaki hücreleri daha kolay çözümleme için farklı renklerde özetlenmiştir. Bu fikir birliği sıraları ve diğer eğilimleri için yinelenen bu dizilere kontrol etmek için tavsiye edilir. Bu Kalign ve Clustal Omega gibi sıra hizalama yazılımları tarafından destekli ve çözümleme (bunların ortaya frekansta yinelenen ve yinelenmeyen dizileri de dahil olmak üzere) tüm sıra çıktı ve aşağı seçilen listesi yapılır dizileri (ile ya da ezelî onların göreli sıklığı) yinelenen. PA ve frekans dikkate almadan dizileri, yinelenen abrax için temsilcisi sonuçları şekil 5A ‘ gösterilir ve 5B, anılan sıraya göre. PA hedef, bireysel yinelenen dizileri kendilerini birkaç içeren için fikir birliği sıra WFCFTC (ya da benzer bir dizi), 5A rakam bir Kalign için Jalview yazılım analizi uygulanarak belirlendi kırmızı altı çizili olduğunu unutmayın Yinelenen dizileri dizi hizalaması. Bu fikir birliği, WXCFTC, daha önce sıralama yöntemi 9güven sağlayan bir PA bağlama, esası tespit edilmiştir. Nerede abrax hedef için yinelenen serileri aynı şekilde analiz edildi, şekil 5Biçinde sonuç oldukça farklıydı. İlk olarak, on beş yinelenen dizileri (% 44 daha fazla kolonileri Ayrıca PA için sıralı rağmen) biopanning yuvarlak 4 den PA bağlayıcılar için izole aksine abrax ciltler için biopanning yuvarlak 4’te tekrarlanan sadece beş dizileri vardı. İkincisi, hiçbiri beş yinelenen sıralarının en umut verici “fikir birliği” sıra (FWAWF, mor altı çizili) bulunan, her ne kadar aday AX-A15 bulunan en iyi dizisi (FWDTWF) eşleşen. Daha fazla çözümleme, bağlama benzeşme ve özgüllük belirlenmesi, aşağıda açıklandığı gibi şekil 5C, bağlamasında abrax için en iyi beş aday üzerinden belirlenen FWDTWF fikir birliği sağlamak için yardım dahil olmak üzere. Her yinelenen serisinden temsilcisi bir koloni daha fazla hücre içi benzeşme ve özgüllük FACS, olduğu gibi şekil 6A biopanning abrax bağlama peptidler için üzerinden yinelenen sıralarının kullanarak için analiz edilebilir. Burada tüm beş yinelenen dizilerini rivax, negatif sıralama veya streptavidin, sıralama için kullanılan manyetik boncuklar nedeniyle sırasında olduğu için kullanılan yapısal olarak benzer protein daha abrax, hedef için daha yüksek ilgi olduğu açık görülüyor biopanning. Bu benzeşimi için zaten umut verici sonuçlar ile tutarlı ve açık nerede şekil 3’ te, o zenginleştirme bağlama hedef abrax, için için gösterilen sıralama el özgüllük ile biopanning her turun artıyor benzer protein, rivax, benzeşim değil. Yinelenen kullanarak abrax sıralama round 4 yalnız dizileri için ancak, tatmin edici bir fikir birliği sıra tespit edildi değil (şekil 5B ve tartışma yukarıda). Dizileri benzer o bir ek aday, AX-A12, içinde belirtilmişti FWDTWF sıra içerdiği öngörülen uzlaşma ile en iyi eşleşen arama izole zaman AX-A15 100 sıralı sömürgelerine round 4 dönen, ancak, bu göz tarafından belirtilmişti , ve başka bir aday, AX-A14, benzer bir yer alan dizi, DWNTWF. Bunlar ve yinelenen sıralarını benzerlikler içerdiği, yinelenmeyen diğer dizileri benzerlikler gösterdi veya rastgele seçilmiştir diğer dizileri tarafından FACS benzeşme ve özgüllük bağlama için analiz edildi. Bu test Sarkes vd. 2016 1 ‘ sıralanır ve bu analiz en iyi 5 bağlayıcı şekil 6B, FWDTWF, şekil 5Ciçinde gösterilen olarak belirlenen fikir birliği sıra ile gösterilir. En iyi bağlayıcı PA-488 nMFI:SAPE nMFI, oranı tarafından sıralanır gibi WXCFTC fikir birliği veya benzer bir içerdiği benzeşme PA hedef tanımak peptidler yuvarlak 4 biopanning / peptid serilerini yinelenen için Binding benzer bir analiz ortaya sıra (Tablo 1). Bu oran kullanılarak, dizileri fikir birliği bulunan ve did değil kendi kendine organize. En iyi adaylar, tüm içeren dizileri ile ilgili fikir birliği için benzer şekilde şekil 6, abrax için yukarıda açıklanan yöntemleri Sarkes ve ark. 2015 14′ te sunulan analiz edildi. Bu sonuçlar göstermek için bazı hedefler, dizileri tekrarlayan olan peptidler analizini bağlayıcı önemli benzeşme ve seçilmiş bir hedef için özgüllük ile elde etmek ve olabilir bir fikir birliği sırası belirlemek için yeterli olabilir, kendi içinde yeterli olması bağlama için. Dikkat, ancak, tekrar sayısını ilgi (Tablo 1) hedef için göreli bağlama ilgi yansıtmayabilir. Analiz dizileri yalnız yinelenen bir desen belirlemek için yeterli değildir, bu dizi analizi ve aday havuzu dar ve eğilimleri daha yüksek benzeşimli bu adaylar arasında reexamine için bağlama analizi arasında geçiş için yararlıdır . Hatta bir eğilim yinelenen dizileri yalnız analiz görülmektedir durumunda ek yinelenmeyen dizileri aynı eğilimleri veya daha fazla araştırma yapılması üzerine diğer eğilimleri göstermek. Şekil 1: bakteriyel görüntü kitaplıkları için biopanning protokolünün şematik. Aşağıda gösterildiği gibi biopanning bakteriyel görüntü kitaplığı döngüsel bir süreci yanlış. Her hücre bakteriyel görüntü Kitaplığı’ndaki (malzemelerin tabloya bakın) hücreleri plazmid bir direnç gen (Bu örnekte choloramphenicol) içeren antibiyotik varlığında yetişkin olduğu sürece korunur plazmid DNA içerir. Her plazmid aynı zamanda dış hücre için rasgele bir peptid gösterir ekran iskele protein kodlar. Her hücre yalnızca bir tek plazmid DNA dizisi içermelidir beri her hücre hücre membran boyunca birden çok yerde sadece tek bir peptid görüntülenmelidir. Bağlı olarak biopanning ve sıralama her turdan sonra kütüphane çeşitlilik düzeyine, DNA dizisi veya hücre hücre benzersiz olmayabilir. Biopanning büyüme ve bireysel peptidler onların dış membran üzerinde görüntülemek üzere hücre kitaplığı indüksiyon başlar. Bu peptidler sonra (hangi biotinylated veya aksi takdirde yakalama için öğesini) bir hedef protein etkileşim kurabilirsiniz. (MCS) sıralama hücre, manyetik-harekete geçirmek için ilişkisiz protein kaldırılır ve hücreleri bir yakalama protein (Bu örnekte, biotin güçlü etkileşim vardır streptavidin) ile kaplı olan manyetik boncuklar ile inkübe. Tüm kültür sonra ilişkisiz hücrelere bağlı hücreleri ayırmak için bir mıknatıs maruz kalmaktadır. Otomatik bir manyetik sıralama aygıtı kullanarak yanlış pozitif azaltmak hücre ayrılması için tercih edilir. Burada resimli hangi bağlanmıştır ve manyetik boncuklar ile ortak elute hücreleri korunur olumlu bir tür olduğunu. Kapalı manyetik boncuklar yıkanır hücreler yerine korunur dışında genellikle ön gerçekleştiriyoruz, negatif sıralama için süreç aynıdır. Kütüphane kesir bağlı faiz, (pozitif sıralama) veya ilişkisiz (negatif sıralama), gecede büyüdü ve sıralama sonraki turda kullanılan. Pozitif biopanning izleyen her turda bir düşüş sıkılık geliştirmek için hedef konsantrasyon ve boncuk birimi gerektirir. Biopanning her turdan sonra benzeşme ve protein hedef için peptidler özgüllüğü biopanning durdurmak ve bireysel adaylar soruşturma başlatmak ne zaman belirlemenize yardımcı olması için Floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanarak değerlendirilir. Gerektiğinde, DNA sıralama ve peptid dizi analizi yapılmaktadır. Çözümleme adımları kendilerini özellikle bireysel yalıtır eğilimler biopanning son turdan sonra ifşa için döngüsel bir süreç olabilir. Bu noktada, peptit dizisi eğilimler ve/veya fikir birliği benzeşme ve özgüllük bağlama ile ilişkili. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: örnek veriler için mermi sıralama FACS analizi: PA hedef. FACS tarafından belirlenen benzeşme bağlama biopanning (pozitif sıralama) seçilen bakteriyel görüntülemek hedef için koruyucu antijen (PA) bağlama peptidler kitaplığının 4 tur sonra gösterilir. Bu ilk streptavidin kaplı manyetik Boncuklar karşı olumsuz bir sıralama gerçekleştirdikten sonra gerçekleştirildi. Bağlama değerlendirme için hücreleri %0,4 ile indüklenen L-arabinoz kuluçka FACS tarafından çözümleme ve kontrolü ve hedef önce 90 dk için. Benzeşme analiz hedef için bağlama kırmızı kutulu. Scatter araziler FITC-A vs FSC burada gösterilir-A ve (karşılaştırıldığında PBS ile inkübe geçişli negatif kontrol) bağlı yüzde hücrelerdeki değerleri ve medyan floresan yoğunluğu (nMFI, peptid-Alerjik negatif kontrol ile inkübe göre normalize aynı fluorophore etiketli protein) ile 45 dakika inkübe indüklenen hücre: PBS arabellek yalnız, 150 nM YPet Mona (peptid ifade için pozitif kontrol) veya 250 nM PA-488 (hedef etiketli). Benzeşme faiz hedefi için biopanning her turdan sonra bağlama içinde artan zenginleştirme unutmayın. Şekil 3aksine, tüm autoMCS hücre ayrımlarını kullanarak program Posselds tamamlandı. Dağılım parsellerde FITC-A vs burada gösterilen FSC-A araziler FITC-H vs FSC-H Sarkes ve ark. 2015 14 karşılaştırma için bu verilerin bir kısmını da görüntülenmeyecektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: örnek veriler için mermi sıralama FACS analizi: abrax hedef. İşte tam biopanning deney için karşılaştırmalı bağlama ilgi FACS tarafından belirlendiği gibi gösterilen benzer şekilde Şekil 2. Bakteriyel görüntü kitaplığı streptavidin kaplı manyetik boncuklar, Şekil 2, karşı negatif sıralama için maruz kaldığı ama sonra benzer yapısı ile homolog bir protein karşı negatif sıralama ek bir raunt için maruz kaldığı ve işlev, rivax peptidler hedef için abrax bağlama için olumlu biopanning 4 tur gerçekleştirmeden önce. Bağlama değerlendirme için hücreleri %0,4 ile indüklenen L-arabinoz hedef, pozitif kontrol ve negatif denetimlere bağlama ve FACS üzerinde okuma önce 45 dk için. Hedef için ilgi bağlama kırmızı kutulu. Scatter araziler FITC-A vs burada gösterilir FSC-A (veya PE-A vs FSC-A SAPE durumunda) ve yüzde hücrelerdeki değerleri bağlı (karşılaştırıldığında PBS ile inkübe geçişli negatif kontrol) ve nMFI, indüklenen için 45 dk ile inkübe hücreleri : PBS arabellek yalnız, 150 nM YPet Mona (peptid ifade için pozitif kontrol), 250 nM Abrax-488 (etiketli protein hedef), 250 nM Rivax-488 (etiketli potansiyel cross-reactive protein hedef) veya 250 nM SAPE (negatif kontrol için doğrudan bağlamak için Manyetik boncuklar) streptavidin kaplı. Faiz, abrax, biopanning, her turdan sonra hedef için bağlama ilgi ve yapısal olarak benzer protein, rivax için en az bağlama ilgi artan zenginleştirme unutmayın. Şekil 2aksine, pozitif biopanning round 1 kullanarak gerçekleştirilen autoMCS Posselds program sonraki süre tur sıralama programı Posseld, biopanning bu el yazması için önerilen olarak kullanarak tamamlandı. Dağılım parsellerde FITC-A vs burada gösterilen FSC-A araziler FITC-H vs FSC-H Sarkes vd. 2016 15 karşılaştırma için bu verileri aynı zamanda görüntülenmeyecektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: örnek dizi analizi “eCPX_Sequencing” Makro kullanarak çıktı. Gösterilen biopanning yuvarlak 4 48 sıralı kolonilerin seçilen bakteriyel görüntü kitaplığı PA bağlayıcılar için Posselds yöntemini kullanarak görüntü var. “Özet Tablo” sayfası burada gösterilir. Koloniler sıralama işlemi sırasında belirli dosya adlarını alfabetik sırayla numaralandırılmış ve en az bir kez tekrar dizileri çevreleyen kutulara daha kolay veri analizi için farklı renklerde özetlenen unutmayın. ECPX_Sequencing makro bir tamamlayıcı kod dosyası olarak sağlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: sıra hizalama ve fikir birliği belirlenmesi için iki farklı protein hedefi. Tüm resimler burada gösterilen Kalign online analiz yazılımı 51kullanarak dizileri hizalama sonra Clustal_X boyama ile Jalview yazılımını kullanarak oluşturulan. A) hizalama dizileri PA biopanning üzerinden 4 yuvarlak yinelenen ( Tablo 1ile karşılık gelir). B) hizalama dizileri abrax biopanning üzerinden 4 yuvarlak yinelenen ( şekil 6Aile karşılık gelir). C) abrax biopanning ilk 5 aday hizalamasını FACS analiz bireysel aday tarafından belirlenen 4, yuvarlak ( şekil 6Bile karşılık gelir). Kırmızı çizgi içinde A ve b mor çizgi potansiyel vurgulayarak habercisi yinelenen dizileri sadece, incelerken bağlama abrax için belirlenen fikir birliği diziye altını çizen iken C, bağlama benzeşme incelememiz lazım fikir birliği sıra altını çiziyor. bir fikir birliği içinde biraz hal karar vermeden önce FACS kullanarak. Benzer hizalamaları farklı analiz yazılımı ile oluşturulan Sarkes ve ark. 2015 14 ve Sarkes vd. 2016 1′ de görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6: örnek bağlama benzeşme ve özgüllük FACS kullanılarak analiz bireysel adaylar için. Burada gösterilen A) yinelenen dizileri ve karşılaştırmalı bağlama benzeşim hedef, abrax, biopanning, yuvarlak 4 tarafından belirlenen en iyi B) 5 adaylar için FACS kullanarak kararlı normalleştirilmiş ortalama Floresans yoğunluğu (nMFI) olduğunu. Verileri ortalama (Bar) ve standart sapma (hata çubukları) üç bağımsız Çoğalt deneyler temsil eder. Tüm aday gösterilen rivax (çubuk) Rivax-488, kırmızı, yapısal olarak benzer bir protein ve streptavidin negatif kontrol (SAPE, siyah çubuklar) üzerinde oldukça abrax (abrax-488, yeşil bar) için özel olduğunu unutmayın. İki (AX-07 ve AX-15) yinelenen sıralarının da B top 5 aday arasında olmasına rağmen sonuçları analiz yinelenen yalnız dizileri içinde A ve B gösterir karşılaştırılması en yüksek afinite peptidler yalıtmak için yeterli olmayabilir. Burada gösterilen veri Sarkes vd. 2016 1′ den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Tablo 1: non-spesifik bağlama bireysel tekrar aday için belirli bağlama oranını. Bu örnekte, tekrar sıraların sayısını ve PA (hedef) nMFI SAPE (negatif kontrol) nMFI için oranını PA biopanning 4 yuvarlak üzerinden yinelenen aday serileri için gösterilmiştir. Bu veri göreli PA nMFI:SAPE nMFI oranı tarafından sıralanır ve bilinen WXCFTC fikir birliği ya da kalın yazı tipinde gösterilmiştir ve altı çizili benzer bir dizi varlığı için analiz. Öyle ki bu adaylar fikir birliği ile en yüksek PA nMFI:SAPE nMFI oranına sahip olması ve bu nedenle özellikle hedef ile etkileşim dizileri kendi kendine organize dikkat edin. Gösterilen tek bir FACS deneyden sonuçlarıdır. Peptidler hedef için en düşük benzeşimli ek çoğaltır ve Sarkes ve ark. 2015 14’ te yayımlanan analiz dışlandı. 1 Suppplemental dosyası: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. Suppplemental dosya 2: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları benzeşme Kimyasalları yalıtım için başarılı bir yaklaşım olmuştur ve belirli ölçütlere en uçtaki çevre istikrardır gibi gerekli olduğunda peptidler antikorlar tanıma için yararlı bir alternatif sunmaktadır. Bu kütüphanelerin Biopanning kullanarak autoMCS yöntem tanımlamak burada aerodinamik ve piyasada bulunan autoMCS platformu bu teknoloji için daha geniş bir kitleye uzanır. Geleneksel alternatif MCS/FACS ile karşılaştırıldığında bakteriyel için sıralama yöntemi kitaplıkları görüntülemek, yatırım daha pahalı bir FACS alet sıralama ve ilişkili hücreleri izole verebilir gerektirmediğinden autoMCS yöntemleri daha ucuz olduğu, Burada kullanılan Akış Sitometresi türü yerine, hangi sadece analiz 14yeteneğine sahiptir. AutoMCS kritik adımlarla başarılı biopanning için ayırma programı seçimi, potansiyel çapraz-yanlış pozitif, biopanning, durdurmak ne zaman belirlemek için FACS kullanarak kütüphane zenginleştirme izleme azaltmak için Reaktanları karşı sıralama negatif içerir ve Yüzlerce aday hantal tarama önlemek için aday havuzu akıllı analizi.

Her havuz için peptid serileri farklılıkları nedeniyle biraz farklı analiz stratejileri her ne kadar başarılı biopanning PA ve abrax, iki ayrı hedefler için seçilen bakteriyel ekran Kütüphanesi burada açıklanan örnekler göstermektedir adaylar biopanning dört tur sonra. PA daha doğru sözlü, 144 koloniler halinde en az bir kez tekrarlanan peptid dizilerinden açık eğilimleri gösteren dizi analizi ile böyleydi. Bu fikir birliği bulunan PA hedef için bir fikir birliği sırasını belirlemek yeterli ve bu koloniler yalnızdı veya benzer bir sıra streptavidin negatif kontrol bağlamaya karşı PA bağlama oranı açısından en iyi adaylar vardı. Ancak, bu her zaman durumda olmayacaktır. Abrax hedef için sıralama 100 kolonileri beş yinelenen serileri açtı ancak aromatik amino asitlerin ve aspartik asit veya asparagine içeren eğilimi dışında bu dizilere eğilim daha az açıktı. Yinelenen dizilerinden öngörülen “uzlaşma” sadece edilmiş üretilen ve benzeşme abrax için test ama o tam bir fikir birliği dizi hiçbir üst sıralaması bulunan sıralı kolonileri listesine geri döndü ve gözlenen diğer adaylar ile ortak birbirimizi daha fazla eğilimleri vardı. Aslında, iki kolonileri benzer bir sıra “uzlaşma” triptofan, fenilalanin ve aspartik asit kalıntılarının ama farklı aralığı ile aynı eğilim vardı tekrarlar yalnız, yerine FWAWF (FWDTWF), gelen yer. Bu peptidler bir yinelenen sırası, öyle değildir. Benzer bir değişken içeren bir üçüncü sıra ile birlikte bu iki DNA dizileri abrax benzeşim açısından test ilk 5 bağlayıcı arasında yer aldı. En iyi cilt genel, AX-A05, de benzer eğilimler görünür. Sonuçlar abrax için alternatifler bir yaklaşım birkaç kez dizi analizi ve benzeşme ve özgüllük çözümleme arasında bazen seçtiğiniz hedefe bağlı olarak gerekli olacaktır göstermektedir. Abrax hedef için sonuçları da çok benzer bir protein (rivax 1,15) elde edilebilir özgüllük düzeyi göstermektedir.

Çalışmalarımız için seçili autoMCS programlar Posselds ve Posseld, düşük frekans, ilk nüfusunun % 5 daha az içeren etiketli hedef hücrelerin pozitif seçim için her ikisi de vardı. Her iki durumda da, hücreleri iki manyetik sütunlar boyunca geçmek. Posselds programını durumunda ancak, hücreleri daha yavaş pozlama süresi 41artırmak için ilk sütun geçen. Ek olarak ticari autoMCS aygıt üreticisi tarafından verilen program açıklamaları (bkz: Malzemeler tablo) 41, bu programların birkaç potansiyel programlar ilk bir karşılaştırma sonra seçildi. Her bir programın yeteneği yanlış pozitif negatif kontrol hücreleri homojen bir kültür çekerek önlemek ve başarılı bir şekilde bilinen cilt ortadan kaldırmak faiz bir hedef için bir azaltılarak çivili negatif kontrol hücreleri içeren karışık bir kültür için bilinen cilt yüzdesi karşılaştırıldığında. Burada açıklanan uygulamalardan önemli ölçüde sapma, benzer bir karşılaştırma programı seçimi yeni uygulama için yararlı olabilir. Ancak, daha önce peptid benzeşme Kimyasalları yalıtım biopanning tüm dört tur için bu programlardan birini kullanarak peptidler benzer ile yalıtım için yol gösterdi PA için için bu iki program (Posseld ve Posselds) karşılaştırma sonuçları Yayınlandı benzeşme ve PA için özgüllük ve WXCFTC uzlaşma tespiti. Bu Posseld göre daha hızlı, daha hızlı akış hızı ile ana farklılıklar vardı ve Posselds kullanarak daha fazla benzersiz sıraların yol biopanning dört tur sonra ise hedef için ilgi bağlama bu nedenle biopanning, sadece iki tur sonra daha yüksek 14. bu öğrenme, strateji biraz değiştirildi ne zaman biopanning abrax bağlama peptidler iki yararları dahil etmek için: Posselds çeşitlilik nerede en yüksek, ama sonra daha fazla pozlama süresi bu kritik adımı sırasında izin vermek için yuvarlak 1 kullanılır programı Posseld için için en yüksek afinite bağlayıcı daha hızlı yalıtım Tur 2-4 1,15sırasında geçildi. Bu özellikle nMFI ve yüzde bağlama ile karşılaştırıldığında her iki programda ile yuvarlak 4 sıralama PA round 4 sıralama abrax için daha yüksek hem de yaşından beri abrax için ideal olduğu ortaya çıktı (Şekil 2 ve şekil 3 ve Sarkes ve ark. 2015 14), ama diğer karşı bir strateji ile aynı hedef kullanarak doğrudan bir karşılaştırma daha kesin bir karşılaştırma için gerekli olacaktır. Hangi programın belirli bir uygulama için en iyi bireysel hedef, kullandığı sıralama kitaplığı ve burada açıklanan şartları herhangi bir değişiklik ile elde peptid ifade düzeyine bağlı olabilir.

Tartışılan işte abiyotik malzeme ile biopanning üzerinden potansiyel sonuçları, ama biz de biopanning karşı toplu alüminyum 2için aynı bakteriyel görüntü kitaplığı kullandık. Bu çalışmada autoMCS kullanarak gerçekleştirilmedi ama benzer çalışmalar, malzeme, kullanılabilir veya üzerinde kaplı veya olabilir bir manyetik boncuk için Birleşik autoMCS kullanarak başarılı olabilir. Toplu alüminyum çalışmada, bireysel amino asit analizi ve ikincil yapı modelleme hiçbir fikir birliği sıra kararlı 2yaşından beri ne izole peptidler, bağlama benzeşme kullanıyordu anlamada yardımcı oldu. Bile biyolojik hedefler ile bu yüzden “eCPX_Sequencing” makrodan oluşturulan elektronik tablo tek tek kalıntı frekans analizi ile bir sekme içerir bağlama benzeşme bazı hedefler için neyin yönlendirdiğini anlamak için gerekli olabilir. Ancak, hiçbir yinelenen sıralaması bir fikir birliği olmaması ek olarak görülür ve kalıntı frekans yok desen programı varsa, analiz diğer türleri gerekli olabilir. Ayrıca, daha fazla tur sıralama istenen hedef için yeterli ilgi olanlar aşağı-seçim için aday çok sayıda eleme önlemek gerekli olabilir.

Sonraki nesil sıralama artan durumu ile yakınlık test etmeden önce en umut verici adaylar belirlemek ve zenginleştirme biopanning her turdan sonra kapsamını belirlemek için daha kapsamlı bir çalışma gerçekleştirilebilir. Ancak, onlar kolayca onlarca veya yüzlerce kolonileri rutin koloni sıralama ile izole etmek için yeterince yüksek sıklığı değilseniz bağlama analiz adıma geçmeden dizileri klonlama tarafından yeniden oluşturulması gerekebilir. Bu teknoloji gelişmeler, daha ucuz ve daha rutin haline ve koloni yalıtım için bir seçenek özellikle ile o büyük olasılıkla-ecek biopanning verileri çözümlemek için en iyi yolu duyacaksınız. Bu şekilde bireysel dizileri ve tüm kitaplığı aydınlatma için kurşun, gelişmeye. Ayrıca, sıralama Kitaplığı’ndaki bakteri hücreleri daha hızlı büyüme oranları veya genomik proteinler için bir malzeme bile görüntü ifade, iskele ve peptid olmadan bağlamak mümkün overexpress bakteri ile doğru sıralama önyargı zamanla mutasyona örnek. Gelecek vaat eden adaylar ortaya bir kez, bu nedenle, plazmid DNA izole, taze E. coli, retransforming ve peptid bağlama FACS üzerinden teyit değer. Eğer peptid boş hücre bir biçimde kullanmak planlama, benzeşme da için ücretsiz peptid değerlendirilmesi. Örneğin, hedef SEB için bakteriyel ekran aracılığıyla keşfetti peptid benzeşme reaktifler sentetik hücre içi ve enzim bağlı immunosorbant assay (ELISA) ve hücre (via FACS) Tarih ve hücre içi gibi daha geleneksel yöntemlerle analiz üretildi (via ELISA) ilgi karşılaştırıldığında her iki yöntem 7tarafından belirlenen Kds kullanarak.

Biotin streptavidin etkileşimi gücünü protein hedef ve ilişkili peptidler yakalanması için ideal bir strateji geçici olsa da, bu yordam diğer yakalama stratejileri için değiştirilebilir. Protein için manyetik boncuklar, epoksi ve karboksilik asit boncuklar, gibi doğrudan bağlantı başarılı olmuştur ve bir bağlama adım kaldırır. Ancak, doğrudan eki eki strateji bağlı olarak, belirli veya belirsiz bir şekilde potansiyel bağlayıcı siteleri engelleyebilir. Daha az istikrarlı protein hedefleri taze biotinylated 30 dk içinde olabilir veya depolanan streptavidin boncuk kullanarak ek bir avantaj olduğunu, süre boncuk kendilerini cross-linking için protein ile uzun kuluçka gerektiren eğilimindedir ve gerekirse, dondurulmuş genellikle 2-8 ° C’de depolanan Önerilen başlangıç konsantrasyonu biotinylated protein hedef burada, 600 nM, çoklu hedefleri için başarılı olmuştur, ama bu konsantrasyonu azalır Eğer peptid yakalama reaktifler artan ilgi ile izole etmek mümkün olabilir. Ayrıca, bu yöntem için genişletilmiş ve diğer bakteriyel görüntü kitaplıkları ve diğer organizmalar için değiştirilebilir. Örneğin, aşağıdaki adımları anaerop kullanılmak üzere oksijen yokluğu veya diğer ortamlarda Ekstremofiller peptidler benzersiz özellikleri ile yalıtmak için kullanılmak üzere gerçekleştirilebilir. Gibi geçinmek malzeme veya sentetik üretilen kapalı hücreli peptidler ve/veya fikir birliği için potansiyel olarak ilgi belirli bir hedef olabilir belirlenen hücre içi kullanılır. Sentetik üretilen peptidler daha da daha yüksek benzeşme ve daha sağlam Protein katalize yakalama (PCC) ajanlar algılayıcılar kullanımda veya nerede antikorlar genellikle kullanılacak bağlama için diğer uygulamalar için geliştirilmesi için olgunlaşmış veya tanıma 38,55. Moleküler modelleme ile hedefine, peptid konumunu son zamanlarda abrax bağlama peptidler ve fikir birliği için gerçekleştirilen gibi bağlama şekil 5C 1‘ de listelenen belirlemenize yardımcı olması için kullanabilirsiniz. Genel olarak, biopanning bakteriyel görüntü kitaplığı peptid benzeşme reaktifler için yanlış tanıma antikor üretimini ve protein hedef tespiti ve bu yarı otomatik biopanning hızlı, basit ve güçlü bir alternatif yaklaşım kadar ulaşan uygulamaları ile güvenilir sonuçlar üretmiştir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar ABD Ordu Araştırma Laboratuvarı (ARL) doktora sonrası burs programı, Dr. Justin P. Jahnke randevu ARL ile kontrat ile Oak Ridge Associated üniversiteler tarafından yönetilen destek kabul etmek istiyorum. Finansman kalan sensörler ve elektron cihazları Müdürlüğü ARL, tarafından sağlanan. Yazarlar ayrıca Daugherty’yi laboratuvar UCSB bakteriyel görüntü kitaplığı ve YPet Mona reaktif, Dr Bryn Adams YPet Mona reaktif ARL, Dr. Joshua Kogot ilk çalışmaları için klonlama destek için klonlama için bilgi paylaşımı için teşekkür etmek istiyorum ve biopanning bakteriyel eğitimde görüntü kitaplıkları, Alena sakin Edgewood kimyasal ve biyolojik plazmid hızlı ve abrax arındırmak için kullanılan paylaşım için merkezi ve rivax proteinler, Brandi Dorsey PA bağlama peptidler, Qin Guo yalıtım için teknik destek için abrax bağlama peptidler yalıtım için ön deneyler ve Dr Jessica Terrell bu el yazması ile ilgili yararlı tartışmalar için teknik destek için.

Materials

autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21 (11), 1504 (2016).
  2. Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25 (33), 4585-4591 (2013).
  3. Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17 (10), 731-739 (2004).
  4. Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 (4), 474-480 (2007).
  5. Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75 (2012).
  6. Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
  7. Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27 (12), 739-745 (2014).
  8. Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. . Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. , (2011).
  9. Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6 (11), e26925 (2011).
  10. Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32 (6), 1484-1494 (2011).
  11. Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. , (2012).
  12. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21 (7), 435-442 (2008).
  13. Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15 (4), 825-836 (2006).
  14. Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6 (4), 1 (2015).
  15. Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. , (2016).
  16. Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M., Pramatarova, L. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. , 629-642 (2011).
  17. Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7 (009), (2013).
  18. Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5 (12), 1039-1045 (2008).
  19. Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10444-10448 (1993).
  20. Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15 (1), 29-34 (1997).
  21. Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248 (2), 189-198 (2005).
  22. Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66 (1), 10-14 (2000).
  23. Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10 (4), 296-311 (2005).
  24. Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290 (3), 223-230 (2000).
  25. Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28 (9), 766-772 (2001).
  26. Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13 (6), 382-387 (2000).
  27. Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).
  28. Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. , 155-175 (2015).
  29. London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18 (2), 188-199 (2010).
  30. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  31. Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the “Living” Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21 (8), 985 (2016).
  32. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13 (5), 515-523 (2014).
  33. Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22 (6), 843-848 (2011).
  34. Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9 (12), 525-529 (2004).
  35. Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9 (5), 468-477 (2008).
  36. Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2013).
  37. Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. , (2014).
  38. Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. , (2016).
  39. Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79 (5), 2174-2178 (2007).
  40. Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).
  41. Miltenyi Biotec GmbH. . autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. , (2007).
  42. Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8 (11), e80474 (2013).
  43. . . BD FACSCanto II Operator Course Workbook. , (2007).
  44. . . BD FACSCanto II Instructions For Use. , (2007).
  45. Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (2), 156-165 (2012).
  46. . DNA Sequencing Services Available from: https://www.genewiz.com/ (2017)
  47. Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309 (3), 657-670 (2001).
  48. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7 (1), 539 (2011).
  49. Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6 (1), 298 (2005).
  50. Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20 (3), 426-427 (2004).
  51. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  52. Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7 (10), 9452-9460 (2013).

Tags

Semi-automated BiopanningBacterial Display LibrariesPeptide Affinity ReagentsProtein TargetNegative SortingPositive SortingL-arabinose InductionDownstream Sequence Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image