Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Deborah A. Sarkes; Justin P. Jahnke; Dimitra N. Stratis-Cullum

doi:10.3791/56061

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Published: December 06, 2017

doi:

10.3791/56061

Deborah A. Sarkes¹, Justin P. Jahnke¹, Dimitra N. Stratis-Cullum¹

¹Sensors and Electron Devices Directorate,US Army Research Laboratory

Summary

Bibliotecas de exhibición bacteriana Biopanning es una técnica probada para el descubrimiento de los reactivos de la afinidad del péptido, una alternativa robusta a los anticuerpos. El método de ordenación semi automatizado en este documento ha aerodinamizado biopanning para disminuir la ocurrencia de falsos positivos. Aquí ilustramos el proceso de pensamiento y técnicas aplicadas en evaluar a los candidatos y la minimización de análisis aguas abajo.

Abstract

Biopanning exhibición bacteriana bibliotecas es una técnica probada para el descubrimiento de reactivos péptido afinidad para el reconocimiento de objetivos tanto bióticos como abióticos. Reactivos de afinidad péptido pueden ser utilizados para aplicaciones similares a los anticuerpos, incluyendo detección y terapéutica, pero son más robustos y capaces de realizar en entornos más extremos. Enriquecimiento específico de agentes de captura de péptido a una blanco de la proteína de interés es mayor usando métodos de clasificación semiautomáticos que mejoran enlace y pasos de lavado y por lo tanto disminuyen la aparición de falsos positivos aglutinantes. Un método semiautomático de ordenación está descrito en este documento para su uso con una comercial automatizada magnético activado la célula clasificación de dispositivo con una pantalla bacteriana sin restricciones clasificación biblioteca expresar péptidos al azar 15-mer. Con ligeras modificaciones, estos métodos son extensibles a otros automatizados dispositivos, otra clasificación de las bibliotecas y otros organismos. Un objetivo primordial de este trabajo es proporcionar una metodología completa y exponer el proceso de pensamiento aplicado en el análisis y reducir al mínimo el número resultante de candidatos. Estas técnicas incluyen el análisis de enlace en el celular usando celular activado por fluorescencia (FACS), de clasificación para evaluar la afinidad y especificidad durante la clasificación y comparación de candidatos en lo individual, y el análisis de péptidos de las secuencias para identificar tendencias y Secuencias consenso para comprender y mejorar potencialmente la afinidad y especificidad para el destino de interés.

Introduction

Biopanning es una técnica probada para el descubrimiento del reactivo de afinidad, con bacterias bibliotecas una fuente conveniente de péptido afinidad reactivos ¹^,²^,³^,⁴^,⁵^, ⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^, ¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^, ²⁴. Semejantemente a fago exhibición ²⁵^,²⁶ y ²⁷^,²⁸de exhibición de levadura, los péptidos son expuestos en la superficie celular y están disponibles para enlazar a objetivos tanto bióticos como abióticos, con estas interacciones impulsado por el esqueleto peptídico y las propiedades únicas de las cadenas laterales del aminoácido del ²⁹. En contraste con visualización de fagos, las bacterias ellos mismos son uno mismo-repliegue y contienen todo el material genético necesario para pantalla sin elución de fagos enlazados y la reinfección de las células. En contraste con la exhibición de la levadura, es más rápido debido a la rápida (aproximadamente 20 min ³⁰) tiempo de Escherichia colide duplicación bacteriana pantalla. Los reactivos de afinidad péptido resultante pueden ser producidos fuera de célula para el uso en una variedad de plataformas ¹⁶^,¹⁷^,²⁶ de detección y tienen potencial de uso como materiales de la vida cuando aparece en celular ² ^, ³¹ ^, ³². en comparación con los anticuerpos monoclonales para el reconocimiento de objetivos específicos, los péptidos son mucho más pequeños y más flexibles, y pantalla bibliotecas de péptidos pueden ser fácilmente manipuladas a nivel de ADN para evitar determinados aminoácidos, como cisteína ³³. Péptidos son cada vez más explotados para la terapéutica ³⁴^,³⁵^,³⁶ y otras aplicaciones donde los anticuerpos normalmente se utilizarían debido a su facilidad de descubrimiento, reproducible sintético (fuera de la célula ) producción y mantenimiento superior de rendimiento en ambientes extremos, proporcionando un reactivo funcional incluso después de la exposición a altas temperaturas o almacenamiento a largo plazo sin refrigeración ³⁷^,³⁸. La capacidad de superar la cadena de frío para el almacenamiento de los reactivos es de particular interés para el Departamento de defensa, por ejemplo, que deben operar en ambientes extremos. Estabilidad térmica por lo tanto era una característica deseable para los reactivos de afinidad reconociendo las metas solicitadas dadas como ejemplos de este manuscrito.

Recientemente, ha adquirido biopanning exhibición bacteriana bibliotecas aún más directa y confiable con el uso de celular activada por el magnético semiautomático (MACS o MCS) métodos ⁹^,¹⁴^,³⁹de la clasificación. Estos métodos se han demostrado para objetivos biológicos utilizando varios similares plataformas con diferentes ventajas, entre ellas un comercialmente disponibles de clasificación automatizada celular activada por el magnético clasificación instrumento (autoMACS o autoMCS) (ver tabla de materiales) ¹^,¹⁴^,¹⁵ y dispositivos más especializados que incluyen la muestra en un cartucho desechable ⁷^,⁹ o chip ³⁹, una especificación de valor para el uso con organismos o toxinas que son nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) o más⁷. Estos métodos semiautomatizados podrían extenderse para ordenar para péptidos capaces de unirse a materiales abióticos, si los materiales son magnéticos o tienen la capacidad de cubrir a una tira magnética y para uso con diversos organismos (como bacterias anaerobias) si la clasificación y se alteran las condiciones de crecimiento. Además de clasificación bacteriana pantalla bibliotecas, el instrumento de autoMCS comercial utilizado aquí ha sido también utilizado en parte para los primeros pasos del descubrimiento de fragmentos de anticuerpos de cadena simple humanos aparecen en la superficie de la levadura, seguida por el aislamiento más utilizar fluorescentes activa célula clasificación (FACS) ⁴⁰. Las principales ventajas de semi-automatización se disminuyen clasificación de tiempo y esfuerzo y más robusta y reproducible eliminación de células independientes de las bolas magnéticas durante pasos de lavado, que conduce a menor de falsos positivos, rondas de clasificación requiere menos y menos complicada análisis de down-stream ⁹^,¹⁴. En el caso del instrumento de autoMCS comercial, hay varios programas precargados que pueden ser óptimos para diversos usos, tales como negativa pre-sorting (agotamiento), priorizando la pureza, reduciendo al mínimo el volumen de la muestra final y aumentar o disminución de sensibilidad para el aislamiento de las células raras ⁴¹.

El objetivo de este trabajo es demostrar la metodología de biopanning una biblioteca de exhibición bacteriana utilizando el instrumento de autoMCS disponibles en el mercado y a exponer el proceso de pensamiento aplicado en el análisis y reducir al mínimo el número resultante de candidatos en orden a facilitar la extensión a otras aplicaciones. La biblioteca de visualización utilizada aquí (véase tabla de materiales) ¹²^,¹³ contiene aproximadamente 10⁹– 10¹¹15-mer único péptidos visualizar a través de una versión modificada de la proteína de la membrana externa bacteriana OmpX en un naturaleza sin restricciones en la superficie celular, que se espera que sea representante del péptido libre en solución si se produce sintéticamente. Este andamio de proteínas además contiene un péptido control positivo P2X en la terminal C para el control de la expresión vía Unión a YPet Mona. Sin embargo, una biblioteca comprada o novela con adecuada diversidad y otras características necesarias para la aplicación específica que se desea debe trabajar igualmente con este procedimiento biopanning, aunque pueden requeridos algunos cambios de menor importancia. Un esquema de este protocolo biopanning se ilustra en la figura 1. Además, el protocolo podría ser adaptado a otro automatizado plataformas clasificación magnéticas y otras estrategias de ordenación. Manual de clasificación magnética con un imán de sobremesa se ha demostrado con éxito, aunque con análisis posterior más complicado y desperdiciador de tiempo requerido debido a aumentado falsos positivos ¹⁴y, sin embargo, proporciona una opción alternativa a la autoMCS pasos si ninguna celda magnética automatizada clasificación de dispositivo está disponible.

Protocol

1. Biopanning bacteriana pantalla bibliotecas usando autoMCS Nota: Este protocolo de clasificación basado en la autoMCS ha sido descrita 14, y una más profunda «ampliado protocolo para nuevos usuarios”está disponible en los materiales complementarios para este manuscrito para obtener información detallada, incluyendo una explicación del potencial modificaciones. Si un dispositivo de autoMCS está disponible para ordenar, vea el protocolo suplementario de Sarkes et al. 2015 desde un manual de protocolo de clasificación es también descrito en trabajo 14. El protocolo de autoMCS siempre aquí ha sido más adaptado para incluir medidas adicionales de clasificación negativos especificidad mejorada 1,15. Un esquema de este protocolo biopanning se ilustra en la figura 1. Clasificación para eliminar carpetas que cruz-reaccionan con bolas magnéticas negativas Inocular 500 mL de caldo de Luria Miller (LB) que contiene apropiado antibiótico con aproximadamente 1 x 1011células de una diversidad bacteriana Mostrar la clasificación de la biblioteca (véase tabla de materiales).Nota: La exhibición bacteriana péptido biblioteca usada aquí (véase tabla de materiales) contiene aproximadamente 109- 1011miembros únicos 8,12 y se cultiva en LB que contiene cloranfenicol 25 de μg/mL (Cm LB25). El resto del presente Protocolo se asume que se utiliza esta biblioteca. Incubar a 37 ° C con agitación a 225 RPM hasta que el cultivo alcanza un OD600 0.5 – 0.55. Inducen la expresión de péptidos con 0.04% w/v L-arabinose diluyendo un 4% stock 1: 100, agitándolo a 225 RPM durante 45 minutos a 37 ° C. Lugar inducida por la cultura en el hielo. Centrifugar aproximadamente 2 x 1011 células a 6000 x g durante 20 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1,5 mL PBS agitando suavemente.Nota: Un OD600 de 1.0 aproximadamente equivale a 1 x 109 células/mL para e. coli.Nota: no agitar con VORTEX como esto pueden lisar las células; Resuspender con la mano o agitando brevemente a ≤ 225 RPM, 4° C. Las células de transferencia a tubos de microcentrífuga y centrifugar a 6.000 x g por 5 min a temperatura ambiente o 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 1 mL tamponada fosfato salino (PBS) que contiene 0.5% de albúmina sérica bovina (BSA; PBS-B). Lavado 300 μL de perlas recubiertas de estreptavidina (aproximadamente 3 x 109 granos, véase tabla de materiales) en 1 mL de PBS-B y centrifugar durante 5 min a ≥ 5, 000 x g (RT). Coloque el tubo en un separador de partícula magnética superior del Banco. Retire con cuidado el sobrenadante, evitando los pellets. Resuspender las cuentas en el celular además de mezcla de PBS-B preparado por encima. Incubar a 4° C sobre una plataforma giratoria para las muestras de lugar de 45 min en hielo. Encienda el instrumento autoMCS para inicializar el sistema. Primera líneas de funcionamiento del fabricante y tampones de lavado (véase tabla de materiales) seleccionando “Lavado ahora” en la parte inferior de la pantalla en el menú de “Separación”, luego “Enjuague” y “Run”. Cebe el sistema con PBS-B, en PBS-B como tampón de lavado y tampón ejecutando los siguientes pasos. Seleccione el menú de “Separación” de la barra de navegación superior y seleccionar “Lavado ahora”. Seleccione “Enjuague” y “Run” para cebar el sistema con PBS fresco-B. Transferencia celular y grano de la mezcla del paso de incubación a un tubo cónico de 15 mL. Coloque este tubo en la ranura de la muestra y vaciar tubos cónicos de 15 mL en las ranuras de selección positiva y negativa, de una rejilla previamente refrigerada (4 ° C) (véase tabla de materiales). Coloque la parrilla en la plataforma de instrumento. Asignar un programa de separación para cada muestra en el estante (hasta 5 muestras se puede clasificar en una carrera). Añadir un paso de “Enjuague” entre cada muestra y después de la última muestra. Seleccione “Ejecutar” para iniciar la separación de la célula. Seleccione “OK” para confirmar que hay disponible suficiente memoria intermedia.Nota: El programa de separación de “Posselds” funciona bien para la clasificación negativa y positiva clasificación ronda 1 y “Posseld” se prefiere para la clasificación de rondas 2-4, pero dos de estos programas se han utilizado con éxito por toda negativa y positiva clasificación de rondas 14 ,15 y otros programas pueden resultar mejores para una aplicación particular (se describe más en discusión). Cuando el programa haya terminado, retire la rejilla y retener la fracción apropiada. Aquí, una especie negativa, conservan fracciones negativas (contiene células sin granos). Coloque en hielo. Utilizar la fracción de tipo negativo en su totalidad para inocular 1L Cm LB25 0,2% w/v D-glucosa. Crecen durante la noche a 37 ° C, agitando a 225 RPM. Antes de apagar el instrumento autoMCS, cambiar los topes de ejecución y lavar a funcionar del fabricante y tampones de lavado (véase tabla de materiales). Seleccione “Lave ahora”, luego “” y “Run”. Cuando haya terminado, asegúrese de que hay 70% de etanol en la línea de descontaminación, luego pulse el icono de”encendido” en la esquina superior derecha de la pantalla y seleccione “Sí”. Cuando es completo el apagado del sistema (las botellas será púrpura), apagar la máquina. Al día siguiente, utilizar la cultura durante la noche para realizar acciones de congelador con cerca de 1 x 1011células por frasco en LB con 15% de glicerol. Además, o bien, utilizar esta cultura en el paso siguiente: la clasificación negativa adicional (sección 1.2) o la primera ronda de clasificación positiva (sección 1.3). Negativa ordenar para eliminar carpetas que cruz-reaccionan con otros objetivos de interésNota: Sección 1.2 pueden ser saltados si ninguna otra clasificación negativa es necesario o deseado. En ese caso, proceder a la sección 1.3. Enlace residual a todos los destinos no deseados puede evaluarse por FACS como en sección 2: análisis FACS de rondas de clasificación. Para la clasificación negativa contra una blanco de la proteína específica, tal como una proteína similar con potencial también unen a los péptidos descubiertos 1,15, repita los pasos del crecimiento e inducción 1.1.1 – 1.1.3, a partir de un stock congelado de Biblioteca de estreptavidina-agotado de paso 1.1.15 o la cultura durante la noche de paso 1.1.12 (con OD600 a estimar y a inocular con celdas de 1 x 1011 ). Las células de transferencia a tubos de microcentrífuga y centrifugar a 6.000 x g por 5 min a temperatura ambiente o 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con un objetivo de proteína cruz-reactivo de biotinilado de nM 600. Incubar a 4 ° C durante 45 minutos sobre una plataforma giratoria.Nota: 600 nM es una concentración inicial sugerida, que puede ser alterada si se observa un notable beneficio. Biotinilación de destino de la proteína puede ser alcanzado y cuantificados utilizando los reactivos sugeridos en la tabla de materiales. Mientras tanto, lavar 100 μl de streptavidin recubierto granos (aproximadamente 1 x 109 ) en 1 mL de PBS-B y centrifugar durante 5 min a ≥ 5.000 x g (a RT). Coloque el tubo en un separador de partículas magnéticas superiores del Banco y cuidadosamente eliminar sobrenadante, evitando los pellets. Centrifugar las células objetivo limita a 6.000 xg durante 5 min (RT o 4° C), retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS-B. Resuspender los granos en todo volumen de las células lavadas a blanco cruz-reactivo de proteína. Incubar a 4° C sobre una plataforma giratoria para 30 minutos. Coloque la muestra en hielo y los pasos completos 1.1.7 – 1.1.15 una especie negativa, haciendo acciones de congelador apropiada. Seguir sección 1.3 para un tipo positivo si se ha logrado la clasificación negativa deseada de todos, o repetir sección 1.2 a tipo negativo contra otra proteína cruz-reactivo potencial. Tipo positivo 1 rondaNota: Ronda 1 clasificación positiva contra una proteína específica de destino es similar a una especie negativa contra un objetivo específico de la clasificación (véase 1.2) excepto que se retiene la fracción que contiene el grano, positivo. Inocular 500 mL de LB Cm25 con aproximadamente 1 x 1011células de una diversidad bacteriana Mostrar biblioteca clasificación que ha sido empobrecido de estreptavidina y crecido durante la noche (de paso 1.1.12) o congelada (de paso 1.1.15) y descongelada en el hielo, o que ha sido más empobrecido de las carpetas a otros objetivos de la cruz-reactivo de proteína (de paso 1.2.5), como se desee. Incubar a 37 ° C con agitación a 225 RPM hasta que el cultivo alcanza un OD600 0.5 – 0.55. Inducen la expresión de péptidos con 0.04% w/v L-arabinose diluyendo un 4% stock 1: 100, agitándolo a 225 RPM durante 45 minutos a 37 ° C. Lugar inducida por la cultura en el hielo. Centrifugar aproximadamente 2 x 1011 células a 6.000 x g por 20 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1,5 mL PBS agitando suavemente (a mano o agitando brevemente a ≤ 225 RPM, 4° C). Las células de transferencia a tubos de microcentrífuga y centrifugar a 6.000 x g por 5 min a temperatura ambiente o 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con 600 nM biotinilado proteína objetivo interés. Incubar a 4 ° C durante 45 minutos sobre una plataforma giratoria.Nota: 600 nM es una concentración inicial sugerida, que puede ser alterada si se observa un notable beneficio. Biotinilación de destino de la proteína puede ser alcanzado y cuantificados utilizando los reactivos sugeridos en la tabla de materiales. Mientras tanto, lavar 100 μl de streptavidin recubierto granos (aproximadamente 1 x 109 ) en 1 mL de PBS-B y centrifugar durante 5 min a ≥ 5.000 x g (a RT). Coloque el tubo en un separador de partícula magnética superior del Banco y retire con cuidado el sobrenadante, evitando los pellets. Al terminar la incubación con el objetivo, centrifugar las células objetivo limita a 6.000 x g durante 5 minutos (RT o 4° C) para eliminar cualquier proteína de Diana. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS-B. Resuspender los granos en todo volumen de las células lavadas a destino de la proteína. Incubar a 4° C sobre una plataforma giratoria para 30 minutos lugar en hielo. Encienda el instrumento autoMCS para inicializar el sistema. Primera líneas funcionamiento del fabricante y tampones de lavado (véase tabla de materiales) seleccionando “Lavado ahora” en la parte inferior de la pantalla en el menú de la separación, entonces “Enjuague” y “Run”. Cebe el sistema con PBS-B, en PBS-B como tampón de lavado y tampón ejecutando los siguientes pasos. Seleccione el menú de separación de la barra de navegación superior y lavado ahora. Seleccione Enjuague y Run para cebar el sistema con PBS fresco-B. Transferencia celular y grano mezcla de paso de incubación anterior a un tubo cónico de 15 mL, enjuagando el tubo con un adicional de 500 μl de PBS-B y agrupación de la colada con la muestra. Coloque este tubo en la ranura de la muestra y vaciar tubos cónicos de 15 mL en las ranuras de selección positiva y negativa, de una rejilla previamente refrigerada (4 ° C) (véase tabla de materiales). Coloque la parrilla en la plataforma de instrumento. Asignar un programa de separación para cada muestra en el estante (hasta 5 muestras se puede clasificar en una carrera). Añadir un paso de “Enjuague” entre cada muestra y después de la última muestra. Seleccione “Ejecutar” para iniciar la separación de la célula. Seleccione “OK” o “Continuar” para confirmar que hay disponible suficiente memoria intermedia.Nota: El programa de separación de “Posselds” funciona bien para la clasificación negativa y positiva clasificación ronda 1 y “Posseld” se prefiere para la clasificación de rondas 2-4, pero dos de estos programas se han utilizado con éxito para todo negativo y positivo de clasificación rondas 14 , 15 y otros programas pueden resultar mejores para una aplicación particular (se describe más en discusión). Cuando el programa haya terminado, retire la rejilla y retener la fracción apropiada. Aquí, una especie positiva, conservan fracciones positivas (que contiene las células y los granos). Coloque en hielo. Antes de apagar el instrumento autoMCS, cambiar los topes de ejecución y lavar a funcionar del fabricante y tampones de lavado (véase tabla de materiales). Seleccione “Lave ahora”, luego “” y “Run”. Cuando haya terminado, asegúrese de que hay 70% de etanol en la línea de descontaminación, luego pulse el icono de”encendido” en la esquina superior derecha de la pantalla y seleccione “Sí”. Cuando es completo el apagado del sistema (las botellas será púrpura), apagar la máquina. Utilizar la fracción de tipo positivo en su totalidad para inocular 1L Cm LB25 0,2% w/v D-glucosa. Crecen durante la noche a 37 ° C, agitando a 225 RPM. Al día siguiente, utilizar la cultura durante la noche para hacer las reservas del congelador en LB que contiene 15% de glicerol, o seguir positiva clasificación Ronda 2 en la sección 1.4. Posteriores rondas de clasificación positivasNota: Normalmente, de cuatro rondas de clasificación se recomiendan, aunque tres rondas de clasificación son generalmente suficientes 14,15. Cuando dejar de clasificar con la ayuda del análisis FACS de rondas de clasificación se describe en la sección 2. Concentraciones de destino y el volumen de grano magnético disminuyen con cada ronda de clasificación positiva posterior. Uso de la cultura durante la noche de la ronda de clasificación previa (o de un stock de células congeladas de esa ronda), inocular 5 mL LB Cm25 con 100 μl de células (1:50 dilución). Incubar a 37° C con agitación a 225 RPM hasta que el cultivo alcanza un OD600 0.5 – 0.55. Inducen la expresión de péptidos con 0.04% w/v L-arabinose, agitándolo a 225 RPM durante 45 minutos a 37° C. Lugar inducida por las células en hielo.Nota: Esta cultura inducida también puede utilizarse para evaluar la afinidad y especificidad para la ronda de clasificación que se originó, como se describe en la sección 2 a continuación. Centrifugar 1 x 108 células a 6.000 x g por 5 min a temperatura ambiente o 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 50 de μl PBS con la mitad de la concentración de destino de proteína biotinilada de interés utilizado para la ronda previa de clasificación (por lo tanto 300 nM para la 2ª ronda, 150 nM para la ronda 3 y 75 nM para la ronda 4 de nuestra propuesta punto de partida). Incubar durante 45 min sobre hielo (o a 4 ° C una plataforma giratoria). Mientras tanto, lavar los granos recubiertas de estreptavidina (15 μl para la Ronda 2, redondo 8 μL para 3 y 4 μL de Ronda 4) en 1 mL de PBS-B y centrifugar 5 min a ≥ 5.000 x g (RT). Coloque el tubo en un separador de partículas magnéticas superiores del Banco y cuidadosamente eliminar sobrenadante, evitando los pellets. Granos de resuspender en 50 μl PBS-B. Después de la incubación de 45 minutos con destino en paso 1.4.3, centrifugar las células a 6.000 x g por 5 min a temperatura ambiente o 4° C, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 50 μl lavar granos de 1.4.4. Mantener la muestra en hielo y los pasos completos 1.3.7 – 1.3.13 para una especie positiva. Sembrar una cultura de 5 mL de LB Cm25 suplementado con 0.2% w/v D-glucosa con la fracción positiva, que contiene el grano entera de la especie. Al día siguiente, utilizar la cultura durante la noche para hacer las reservas del congelador en LB que contiene 15% de glicerol o continuar a la siguiente clasificación positiva ronda, volviendo a paso 1.4.1.Nota: Utilizando la cultura inducida de 1.4.2 evaluar la afinidad y especificidad como se describe en la sección 2 a continuación puede ayudar a determinar cuándo dejar de clasificación. Si dos rondas de clasificación en una fila muestran afinidad similar, o una ronda más tarde muestra disminución de afinidad para el destino de interés, este deseable lugar para detener la clasificación. Después de la ronda final, vuelta al paso 1.4.1 pero pare en 1.4.2. 2. FACS análisis de rondas de clasificación Usando las células inducidas de paso 1.4.2 para cada ronda de clasificación, o culturas idénticas, añadir 5 μl inducida por células a 25 μl de cada uno de los siguientes preparado soluciones vinculantes de evaluación (ver también tabla de materiales): PBS solo; PBS con 150 nM YPet Mona (YPet 12,13; control positivo para la expresión), si está disponible; destino de la proteína de 900 nM conjugado con un colorante fluorescente, como amina reactiva del tinte con emisión/excitación a 493 nm⁄518 nm (blanco-488); 900 nM cruz-reactivo proteína objetivo (s) utilizado para la clasificación negativa con el mismo tinte fluorescente (proteína-488 Cross-Reactive); y 900 nM estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Incubar en hielo durante 45 minutos.Nota: Si continuando directamente de paso 1.4.2, este se paso siempre hacerse el día después de la biopanning para esa ronda desde la biblioteca de abajo seleccionado fue convertida durante la noche entonces subcultivo y había inducida al día siguiente. También se pueden utilizar cultivos crecido e inducido igualmente de la acción Ronda Clasificación congelados; en ese caso, todas las rondas pueden probadas y comparadas en un solo experimento. Centrifugar las células a 6.000 x g por 5 min a temperatura ambiente o 4° C. Eliminar el sobrenadante y almacenar las muestras en hielo.Nota: Gránulos de la célula pueden almacenarse en hielo hasta que todas las muestras están listas para análisis. Encienda el instrumento FACS, abra el software, puesta en marcha del sistema y calibrar el instrumento siguiendo las instrucciones de 43,44 de fabricante. Dentro del software de la FACS, haga clic en “Administrador” y haga clic en la carpeta deseada o crear una “nueva carpeta”. Haga clic en “Nuevo experimento” icono en la parte superior izquierda de la pantalla. Haga clic derecho icono para “cambiar el nombre” experimento. Dentro de ese experimento, haga clic en “Hojas de trabajo Global”. Haga clic en el icono “Dot Plot”, haga clic en la hoja de cálculo hoja de cálculo global para crear este diagrama de dispersión. En el gráfico de trama de punto sí mismo, haga clic en seleccionar el “Inspector” icono en la parte superior izquierda de la pantalla y ajustar los ejes a biexponential pantalla seleccionando las casillas de “Eje Y” y “Eje X” en la ventana abierta. Cierre la ventana de visualización de biexponential haciendo clic en la X. Crear un “nuevo tubo” haciendo clic en el icono en la parte superior izquierda de la pantalla y cambiar el nombre de la muestra con la información correspondiente haciendo clic derecho el icono de muestra bajo “hoja de cálculo global” y seleccionar “renombrar”. Ampliar la muestra haciendo clic en el (+) signo, luego doble clic en el icono de tubo, haga clic derecho sobre él, y nuevamente seleccionar “rename” para describir la muestra. Utilice este gráfico de trama de punto con defecto SSC-A vs FSC-A realizar una muestra control negativo en PBS solo doble clic en ese tubo o seleccionando la flecha a su lado. Justo antes de ejecutar el ejemplo, Resuspender el precipitado de células en 500 μl hielo frío FACS que un FACS buffer y muestra de la transferencia del tubo (véase tabla de materiales), mezclar por pipeteo y agitando el tubo. Coloque las células resuspendidas en el tubo de inyección de la muestra (SIT) del instrumento. Prensa “adquirir datos” con “Eventos para mostrar” en 30.000-50.000 y “Eventos a Record” en 10.000, caudal en baja (para comenzar; aumentar si es necesario) y “Sentarse a ras” seleccionado.Nota: Velocidad adecuada (bajo, medio o alto) es la velocidad a la que el número de eventos/s es aproximadamente entre 200 y 2000. Utilizar esta gama para todos los pasos. Mientras adquiere, ajuste de umbral de tensión photomultiplier tubo (PMT) si es necesario seleccionando la ficha de “Umbral” haga clic en y cambiar el “valor”. Ajuste tensión de dispersión hacia delante y lateral (FSC y SSC) tal que las células del control negativo en PBS solo ligeramente debajo del centro.Nota: Pueden añadirse parámetros adicionales (por ejemplo, SSC) en la pestaña de “Umbral” mediante el icono “agregar”. Por lo general, voltajes de PMT de cerca de 700 V a 1000 v para SSC y el FSC funcionan bien para e. coli. Si la muestra está leyendo correctamente, ajuste la velocidad de flujo para mostrar la 200-2000 eventos/s y pulsar “Datos de registro”. Cuando haya terminado, retire el tubo de sentarse y coloque en hielo. Elija el icono de “Puerta del polígono” y usa el ratón para dibujar una puerta en la mayoría de la población de células en el diagrama de dispersión. Haga clic en trama de punto y seleccione a “Mostrar jerarquía de población”. Usar esta puerta de “P1” como padre de familia haciendo clic en “P1” en la jerarquía de la población. Crear un nuevo diagrama de punto siguiente paso 2.5. Haga clic con el botón derecho cada eje y cambiar el eje y FITC-a y el eje x a la FSC-A. Puerta del control negativo (PBS solo) usando el icono de la “puerta del polígono”, con la puerta tan estrecha como sea posible alrededor del lado superior e izquierdo de la población.Nota: comprobar la jerarquía de la población para asegurar que la puerta de P1 es un padre de la puerta P2. Si no es así, aparecerá en línea con la puerta P1 y “Todos los eventos” será el padre; eliminar la puerta y volver a crear siguiendo el paso 2.10. Seleccionar “P2” en la jerarquía de la población, haga clic derecho y seleccione “invertir la puerta”. Haga clic derecho sobre la trama de punto con puerta de P2 y seleccione «Mostrar poblaciones». Seleccionar las poblaciones “P2” y “No P2” para la exhibición (menos del 1% de la población debe caer fuera de la puerta). Haga clic con el botón derecho la trama de punto con puerta de P2 y seleccione “Crear vista de estadísticas”. Haga clic derecho en la ventana de vista de las estadísticas y seleccionar “Editar vista de estadísticas”. Haga clic en la pestaña de “Poblaciones” y agregar o quitar poblaciones, según se desee, incluyendo la población de padres, P1 (P2 y P2 no deben ya ser demostrado). Haga clic en la pestaña “Estadísticas” y añadir “FITC-A media” y cualquier otras estadísticas de interés. Cierre la ventana pulsando Aceptar. Crear un gráfico de trama de punto similar para PE-A vs FSC-A y puerta con PBS solo muestra (parcelas anteriores pueden duplicar y alterados). Use esta hoja de cálculo para ejecutar todas las muestras (incluyendo control negativo células incubadas con cada destino fluoróforo) de esta manera, registrar eventos de 10.000 para cada uno.Nota: Las células que caen fuera de la puerta después de la incubación con la proteína de la blanco-488, el YPet positivo control, etc. son aglutinantes a esa proteína, y el valor de “No PX” (donde X es el número de la población privada de ese gráfico) debe registrarse como % límite. Cuando se utiliza como un control negativo de SAPE, utilizar la trama de la FSC-A PE-A vs. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de P1 también debe registrarse ya que esto da la información más allá de la Unión %, mostrar el grado de atascamiento en términos relativos y es más sólido en presencia de valores extremos 45. Intensidad de fluorescencia media puede ser normalizada (INR) dividiendo el MFI de cada péptido por el MFI de un andamio sólo negativo control (ningún péptido N-terminal), o un clon que contiene una secuencia de péptidos que se unen no objeto de interés, después de la incubación con el mismo objetivo conjugada al mismo fluoróforo 14. Si estas células control negativo están disponibles, uninduced las células se incubaron con el mismo objetivo y marcado con el fluoróforo mismo pueden utilizarse para la normalización. 3. secuencia de análisis de potenciales candidatos y evaluación de la afinidad de enlace Determinación de secuencia de péptido Selecciona y secuencia de decenas o cientos de colonias bacterianas de los redondos finales de biopanning (típicamente redondos 3 o 4 son suficientes 14). Analizar la secuencia de datos utilizando específicamente el archivo de la macro que hemos desarrollado (ver información de apoyo para el código, “Sub eCPX_Sequencing”) para analizan las secuencias generadas de biopanning la 15mer biblioteca bacteriana pantalla indicada en la tabla de materiales. Utilice el software de hoja de cálculo en la tabla de materiales, u otro software compatible recomendado:.Nota: Un número de herramientas está disponible en línea que pueden ayudar también en la secuencia de ADN análisis 47. Si lo prefiere, utilice un método diferente de la establecida para el análisis de la secuencia y vaya al paso 3.1.3. Descargar el conjunto de archivos de secuencia (ficheros .seq, documentos de texto también trabajos) y extraerlos en una carpeta nueva. Si es necesario, mueva o copie la carpeta en el disco duro (en lugar de una carpeta de red) para la velocidad mejorada. Abrir una nueva ventana de hoja de cálculo. Asegúrese de habilitar las macros y activar todas las funciones, si esos mensajes pop-up.Nota: Pasos 3-6 a continuación deben sólo necesitará completar la primera vez que la macro se utiliza. Para el análisis posterior, simplemente “ejecutar la Macro” comenzando en el paso 7. Copiar todo el contenido de la macro en el archivo “Sub eCPX_Sequencing”.Nota: La versión actual se configura con que flanquean las secuencias para la biblioteca de 15-mer en la tabla de materiales y traducirá los aminoácidos entre ellos. Secuencias adicionales se pueden introducir mediante la copia que flanquean las secuencias en la columna A y que flanquean las secuencias en la columna B de la hoja de cálculo, hasta 10 secuencias para cada uno, antes de ejecutar la macro de 3′ 5′. En el archivo de hoja de cálculo en blanco, seleccione la ficha “Ver” y, a continuación, haga doble clic en “Macros”. Seleccione la carpeta personal.xlb. Si esto no está disponible, grabar una macro para hacer que este aparezca. Haga clic en “crear” o “entrar”, dependiendo de lo que se puede destacar. Pegue la macro entera en el módulo. Haga clic en el guardar icono o ir a archivo, guardar. Salida del módulo. Si aparece una ventana, presione el botón OK. Ejecute la Macro: vaya a la carpeta donde se encuentran los archivos desired.seq. Haga clic en la barra al lado del icono de la carpeta en la parte superior para ver la ubicación de la carpeta. Al copiarlo. Vaya a la ventana de hoja de cálculo nueva. Seleccione la ficha ver y haga doble clic en macros. Seleccione “eCPX_Sequencing” de la lista y haga clic en “ejecutar”. En el cuadro que aparece, pega la ubicación del archivo copiada en el paso 7 y presiona enter. La macro debe comenzar pasando por las secuencias y organizándolos en tablas en hojas diferentes. Utilizar la hoja “Tabla resumen” para determinar si será necesario comprobar archivos de seguimiento de errores y haga las correcciones manualmente (si secuencias contienen “X” o no se puede traducir).Nota: La “tabla resumen” muestra las secuencias de péptidos traducido, ordenadas por secuencia de aminoácidos (de la A la Z), a menos que un error de secuenciación había prevenido traducción. Una “X” denota un aminoácido individual que no se pudo determinar. Una vez que las secuencias se traducen, organizado, y corrección los errores de secuencia, Compruebe la lista de secuencia de péptido ordenados en la hoja “Tabla resumen” para cualquier secuencia de repetición. Crecen colonias secuenciadas de interés (incluidos los repite o péptidos con tendencias de notables como mínimo) en 5 mL LB Cm25 a 37 ° C, agitando a 225 RPM, los cultivos durante la noche y guardar las reservas del congelador el día siguiente en LB que contiene 15% de glicerol, como en el paso 1.4.7. Pruebe los péptidos con secuencias de repetición para atar afinidad y especificidad utilizando los métodos de FACS se describe en sección 3.3 y utiliza el formato FASTA de la lista de secuencia (lista completa y repite solamente) para alinear las secuencias de uso recomendado: alineación y programas de análisis, como en la sección 3.2. Alineamiento de secuencias usando Clustal Omega, Kalign y programas similares Copiar secuencias en formato FASTA de la hoja de cálculo FASTA de la macro, o de lo contrario, crear una lista de archivos FASTA de las secuencias esté alineado (como las de paso 3.1.3).Nota: Columna A contiene los archivos FASTA en orden numérico por “Seq #” mientras que la columna B muestra ordenados por “Secuencia de AA” de la hoja “Tabla resumen”. La lista de secuencias de péptidos son ordenadas según su secuencia de aminoácidos muestra secuencias inutilizables en la parte superior, como el vector vacío (como “# vacío”) y las secuencias en que ni los criterios de búsqueda de 5′ o 3′ fueron encontrados (como “# valor”). Esta característica permite fácil actualización o eliminación de las secuencias del análisis. Abra Clustal Omega48 o Kalign49 software por ir a la Página Web 50,51, o utilizar otros recomendado: software para alineamiento de secuencias. Copiar y pegar la lista de secuencia FASTA y entrada en el cuadro debajo de “secuencias en cualquier formato compatible”. Cambiar “pena abrir brecha” a 30 bajo “más opciones” en Kalign (esto no es posible en Clustal Omega), pero de lo contrario mantener configuración predeterminada antes de pulsar ‘Enviar’. Análisis de alineamiento de secuencias con Jalview 52,53 software directamente en el software en línea Clustal Omega y Kalign seleccionar la pestaña de “Resumen de resultado” por encima de la alineación y haga clic en el icono “Jalview”.Nota: si se prefiere, o para el análisis de alineaciones de la secuencia generada por programas alternativos, descargar 54 el software por separado y copie y pegue la alineación en la ventana de análisis, que se abre haciendo clic en “Archivo”, “Alineación de entrada”, y ” de cuadro de texto”. Esto proporciona un medio para determinar fácilmente si existe una secuencia consenso en la alineación de la secuencia de entrada. Comparación de afinidad y especificidad usando FACS Sembrar 5 mL LB Cm25 suplementado con 0.2% w/v D-glucosa con cada cepa individual de interés (de paso 3.1.4 o colonias de interés del análisis de la secuencia más en la sección 3.2, etc.) y un control negativo correspondiente (pantalla solo andamio o un péptido que no objetivo, como se describe en la nota de paso 2.13). Crecen durante la noche a 37 ° C, agitando a 225 RPM. Utilizar los cultivos durante la noche para inocular 3 mL LB Cm25 con 60 μL de células (1:50 dilución). Incubar a 37° C con agitación a 225 RPM hasta que el cultivo alcanza un OD600 0.5 – 0.55. Inducen la expresión de péptidos con 0.04% w/v L-arabinose plus 2 mM EDTA (para la facilitación del péptido pantalla 42), sacudiendo a 225 RPM durante 45 min a 37 ° C. Lugar inducida por las culturas en el hielo. Para cada aislamiento, añadir 5 células μl a 25 μl PBS solo o con PBS: 150 nM YPet 12,13 (control positivo para la expresión), si está disponible; 250 nM blanco-488; 250 nM igual cruz-reactivo-488; y 250 nM SAPE (véase 2.1 para más detalle). Incubar en hielo durante 45 minutos. Centrifugar las células a 6.000 x g por 5 min a temperatura ambiente o 4° C. Para sacar el sobrenadante líquido de dibujo desde el lado opuesto de la pelotilla. Almacenar pellets de celular en hielo hasta que todas las muestras y está listo para el análisis. Resuspender cada precipitado de células en 500 μl hielo frío FACS corriendo de tampón, mezclar bien por pipeteo y agitando el tubo, justo antes de la lectura usando un citómetro de flujo (véase tabla de materiales).Nota: Ver paso 2.13 notas para mayor explicación de gating y cálculo del INR a comparar especificidad y afinidad. Ahora se pueden quitar no aglutinantes o ligantes no específicos de análisis, y las carpetas de afinidad más alta deberían ser evaluadas nuevamente por alineación de la secuencia siguiente sección 3.2 para buscar otras tendencias que pueden haberse omitidas en la secuencia inicial población. Las secciones 3.2 y 3.3 se puede repetir según sea necesario las nuevas tendencias y se observan secuencias de consenso. Este análisis puede incluir secuencias más aleatorias si las tendencias no se ven.

Representative Results

Con el uso de célula activada por el magnético automatizada clasificación (autoMCS) en lugar de la clasificación manual celular magnético, falsos candidatos negativos se reducen considerablemente durante biopanning de exhibición bacteriana bibliotecas 9,14. Negativa ordenar pasos que también se puede añadir según sea necesario para reducir aglutinantes no específicos en el destino de interés, y se sugiere como mínimo agregar a un tipo negativo contra el magnético cuentas ellos mismos al frente. Esta selección negativa contra los granos magnéticos se concluyó antes de cuatro rondas de biopanning elegido bacteriano Mostrar biblioteca para aglutinantes de antígeno protector (PA), como se muestra en la figura 2y antes de la selección negativa adicional contra rivax y cuatro rondas de selección positiva para abrax, como se muestra en la figura 3. Las perlas utilizadas aquí son conjugadas a estreptavidina para captura de proteínas biotiniladas, involuntario aislamiento de péptidos vinculante a estreptavidina sí mismo es una preocupación y es monitoreada usando FACS con estreptavidina conjugada a ficoeritrina (figura 3 , SAPE). Mínimo, Unión a estreptavidina debe analizarse cualquier prometedores candidatos individuales al evaluar la Unión a la proteína diana. La Unión y el INR para SAPE deben ser valores bajos en las rondas de clasificación. El nivel de enlace a estreptavidina puede aumentar un poco con cada ronda de clasificación, como ocurrió en la figura 3, porque la población está expuesta repetidamente a las bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina después de cada ronda de clasificación. Si el nivel de enlace de estreptavidina de fondo se convierte en problemático para posteriores análisis, clasificación más negativa contra las bolas magnéticas puede realizarse después de la ronda de clasificación positiva en que la población de unión de estreptavidina aumentó en orden a reducir la posterior detección de falsos positivos. Cuando las proteínas o los materiales disponibles que podrían interferir específicamente con uso aguas abajo del péptido para una aplicación específica, o que se espera que cruz-reaccionan con reactivos de afinidad para el objetivo debido a la estructural o similitud de secuencia, clasificación negativa contra esa proteína o material es recomendó. Un ejemplo es una selección negativa contra rivax antes de aislamiento de péptidos de enlace abrax, debido a la similitud estructural y homología de la secuencia de estas dos proteínas 1,15. Una vez más, cruz-reactivo atar a las proteínas utilizadas para negativa ordenar pasos puede controlarse durante el análisis de la clasificación de rondas utilizando FACS (figura 3Rivax-488). En el mejor de los casos, INR y Unión son bajos, como en este ejemplo. Cuando está disponible, un péptido control positivo fijo, como el péptido P2X en la terminal C del andamio pantalla producido por la biblioteca de exhibición bacteriana usada en los resultados representativos, puede ayudar a determinar si es falta de atar afinidad en el análisis FACS debido a la falta de expresión de la pantalla del andamio, en lugar de falta de afinidad de los péptidos para el destino. En la figura 2 y figura 3, YPet Mona a este P2X péptido se controla y demuestra que las primeras rondas de clasificación expresan el andamio mal. Esto es probablemente predominante debido a la alta frecuencia de codones de parada en péptidos N-terminal en la biblioteca al azar, que significa que el andamio sí mismo no fue producido. Otros efectos pueden contribuir además, como la presencia de péptidos con efectos tóxicos inesperados a la e. coli, o disminución de tasas de crecimiento o péptido pantalla por otras razones (tales como mutaciones en el genoma bacteriano). Adición de EDTA durante la inducción puede mejorar la expresión durante las primeras rondas de clasificación 42, pero aún no ha sido probado. Enlace a YPet Mona en cada biopanning población es mejorada significativamente por ronda 3. Comparando la figura 2 Figura3, también es evidente que nivel de expresión puede mejorarse mediante el aumento de tiempo de inducción a 90 min (como en la figura 2YPet Mona) en lugar de 45 minutos (como en la figura 3YPet Mona), Aunque 45 min es normalmente suficiente. Tenga en cuenta que el INR para YPet Mona se normaliza el nivel de enlace YPet Mona de las células de control negativo para que valores cercanos a 1.0 son típicos si nivel de expresión es aceptable. Normalización YPet Mona MFI a MFI solo PBS de la misma muestra es también una forma válida para comparar los niveles de expresión relativa, pero da mucho los valores más altos (Comparar figura 2 y figura 3 con resultados de Sarkes et al. 2015 15). Enriquecimiento de la biblioteca de péptidos vinculante para el objetivo específico de interés se logra típicamente en tres rondas de clasificación positivas, sino seguir una cuarta ronda de la clasificación puede ser beneficioso, como se muestra en la figura 2 y figura 3 . Por ciento límite células aquí, e INR continúan aumentando de ronda 3 ronda 4 para objetivos de ejemplo, PA y abrax, que están en caja en rojo en la figura 2 y figura 3, respectivamente. Las secuencias de péptidos de afinidad más alta pueden estar ya presentes en la ronda 3 pero están probables que enriquecen aún más en la ronda 4, que ayuda a abajo-selección de posibles candidatos 14. Análisis de secuencias de alrededor de 4 tienden a revelar secuencias de repetición, y repetición de secuencias son un excelente punto de partida para la determinación de secuencia análisis y consenso de afinidad y especificidad. La macro de eCPX_Sequencing como un suplemento a este manuscrito ayuda a simplificar este análisis inicial, como se muestra en la figura 4. Empezando con una carpeta de .seq o archivos de texto, la secuencia de ADN que se encuentra entre solicitadas 5′ y 3′ secuencias es traducido, organizado por la secuencia de aminoácidos y analizado número de residuos de aminoácidos individuales en cada péptido. La lista ordenada de secuencias de péptidos aislados, como se muestra en la imagen de la hoja de tabla resumen en la figura 4, se puede utilizar para determinar fácilmente qué secuencias de repetición y con qué frecuencia. Las células en esta hoja de cálculo que contiene secuencias de repetición están señaladas en diversos colores para su fácil análisis. Se recomienda para comprobar estas secuencias de repetición de secuencias de consenso y otras tendencias. Esto es ayudado por software de alineación de secuencia como Kalign y Clustal Omega y análisis pueden realizarse en la salida de la secuencia completa (incluyendo secuencias de repetición y sin repetición en la frecuencia que aparecieron) y en la lista de seleccionados por abajo de repetición de secuencias (con o sin su frecuencia relativa). Resultados representativos para PA y abrax repetir secuencias, sin tener frecuencia en cuenta, se muestran en la figura 5A y 5B, respectivamente. Tenga en cuenta que en la figura 5A para el objetivo de PA, varias de las secuencias de repetición individuales se contiene la secuencia consenso WFCFTC (o una secuencia similar), subrayada en rojo, que fue determinada mediante la aplicación de software de análisis de Jalview a un Kalign alineamiento de la secuencia de las secuencias de repetición. Este consenso, como WXCFTC, se determinó previamente un consenso de unión de PA, que proporciona confianza en la clasificación del método 9. En la figura 5B, donde se analizaron secuencias de repetición para el destino de abrax de la misma manera, el resultado fue muy diferente. En primer lugar, había solamente cinco secuencias que repiten en la ronda 4 de biopanning para ligantes abrax, a diferencia de las secuencias de repetición quince aisladas de Ronda 4 de biopanning para carpetas de PA (aunque 44% más colonias también fueron ordenadas para PA). En segundo lugar, ninguna de las cinco secuencias de repetición contenida en la secuencia más prometedora de “consenso” (FWAWF, subrayado en color púrpura), aunque candidato AX-A15 contiene la secuencia que mejor emparejado (FWDTWF). Análisis, incluyendo la determinación de la afinidad y especificidad vinculante, ayuda a dar el consenso de FWDTWF determinado a partir de los primeros cinco candidatos abrax Unión en figura 5, como se explica a continuación. Una colonia representativa de cada secuencia de repetición se puede analizar más lejos en célula afinidad y especificidad usando FACS, como en la figura 6A para las secuencias de repetición de biopanning para péptidos de enlace abrax. Aquí está claro que todas las cinco secuencias de repetición tienen una mayor afinidad por abrax, el objetivo que rivax, la proteína estructural similar de clasificación negativa o estreptavidina, que está presente durante la clase debido a los granos magnéticos utilizados para biopanning. Esto es consistente con los resultados ya prometedores para la afinidad y especificidad de las rondas de clasificación que se muestra en la figura 3, donde es claro enriquecimiento para atar a la meta prevista, abrax, está aumentando con cada ronda de biopanning mientras afinidad por la proteína similar, rivax, no es. Sin embargo, una secuencia consenso satisfactorio no fue determinada por el tipo de abrax usando la repetición secuencias de alrededor de 4 solo (figura 5B y discusión). Volviendo a las 100 colonias secuenciadas de alrededor de 4, sin embargo, se observó por el ojo cuando búsqueda de secuencias similares a la mejor coincidencia para el consenso predijo que un candidato adicional, AX-A12, contiene la secuencia FWDTWF que se observó en aislar AX-A15 , y que otro candidato, AX-A14, contenía una similar secuencia, DWNTWF. Estas y otras secuencias que contienen semejanzas a las secuencias de repetición, demostraron semejanzas a otras secuencias no se repiten o fueron elegidos al azar, fueron analizadas por FACS para atar afinidad y especificidad. Las pruebas se clasifican en Sarkes et al. 2016 1 y las superior 5 carpetas de este análisis se muestran en la Figura 6B, con la secuencia consenso que se determina que FWDTWF, se muestra en la figura 5. Un análisis similar de atar afinidad para repetir secuencias de péptidos en la ronda 4 de biopanning para péptidos que reconocen el objetivo de PA reveló que las carpetas mejor, según la clasificación por la relación de PA-488 nMFI:SAPE INR, contienen el consenso WXCFTC o similares secuencia (tabla 1). Utilizando esta relación, las secuencias auto organizan en los que figuran el consenso y los que no. Los primeros candidatos, todos con secuencias relacionadas con el consenso, se analizaron igualmente a los métodos descritos anteriormente para abrax en la figura 6, tal como se presenta en Sarkes et al. 2015 14. Estos resultados demuestran que para algunos objetivos, análisis de péptidos con secuencias de repetición pueden ser adecuada para obtener aglomerantes con gran afinidad y especificidad para un objetivo elegido y para determinar una secuencia consenso que puede ser, en sí mismo, suficiente para el enlace. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el número de repeticiones no necesariamente refleja la afinidad relativa para el destino de interés (tabla 1). Cuando análisis de repetir secuencias solo no son suficiente para determinar un patrón, es útil para alternar entre análisis de secuencia y vinculante para reducir el número de candidatos y reexaminar las tendencias entre los candidatos con mayor afinidad . Incluso cuando se observa una tendencia de analizar las secuencias de repetición solo, pueden demostrar secuencias adicionales no se repiten las mismas tendencias y otras tendencias, con más investigación. Figura 1: esquema de protocolo biopanning para exhibición bacteriana bibliotecas. Como se ilustra aquí, biopanning bibliotecas de exhibición bacteriana es un proceso cíclico. Cada célula en la biblioteca de exhibición bacteriana (véase tabla de materiales) contiene ADN de plásmido que se mantiene siempre y cuando las células se cultivan en presencia del antibiótico para el cual el plásmido contiene un gen de resistencia (choloramphenicol en este caso). Cada plásmido también codifica la proteína pantalla que expone un péptido al azar hacia el exterior de la célula. Puesto que cada célula debe contener sólo una secuencia de ADN de plásmido sola, cada célula debe mostrar sólo un único péptido, en varios lugares a lo largo de la membrana celular. Dependiendo del nivel de la diversidad de la biblioteca en el inicio del biopanning y después de cada ronda de clasificación, la secuencia de ADN puede o no ser única de célula a célula. Biopanning comienza con el crecimiento y la inducción de la biblioteca de la celda a mostrar péptidos individuales en su membrana externa. Estos péptidos pueden entonces interactuar con una proteína diana (que es biotinilado o lo contrario con la etiqueta para la captura). Para celular activada por el magnético clasificación (MCS), proteína se elimina y se incuban las células con bolas magnéticas que están recubiertas de una proteína de captura (estreptavidina en este ejemplo, que tiene una fuerte interacción con biotina). Toda la cultura entonces se expone a un imán para separar células dependientes de células independientes. Utilizando un dispositivo automatizado de clasificación magnético es preferido para la separación de la célula reducir falsos positivos. Aquí es una especie positiva, en la que se conservan las células que están obligados a y responsables conjuntamente con las bolas magnéticas. Un tipo negativo, que realiza normalmente en el frente, el proceso es el mismo excepto que las células que se lavan de los granos magnéticos se mantienen en su lugar. La fracción de la biblioteca de interés limitado (de tipo positivo) o (tipo negativo), es crecido durante la noche y utilizado en la próxima ronda de la clasificación. Cada ronda subsiguiente de biopanning positivo requiere una disminución en el volumen de grano y la concentración blanco para mejorar el rigor. Después de cada ronda de biopanning, afinidad y especificidad de los péptidos para el destino de la proteína son evaluados usando celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación para ayudar a determinar cuándo dejar biopanning y empezar a investigar a los candidatos individuales. Según sea necesario, secuenciación de ADN y análisis de la secuencia peptídica realizan. Estos pasos de análisis pueden ser en sí mismas un proceso cíclico, particularmente para revelar las tendencias en los aislamientos individuales después de la ronda final de biopanning. En este punto, las tendencias de secuencia de péptido o consenso se correlaciona con atar afinidad y especificidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: datos de la muestra para el análisis FACS de rondas de clasificación: destino PA. Atar afinidad por FACS se muestra después de 4 rondas de biopanning (de tipo positivo) el bacteriano elegido Mostrar la biblioteca de péptidos vinculante a la meta, antígeno protector (PA). Esto se realizó después de la primera realización a una especie negativa contra las bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Para la evaluación de enlace, las células fueron inducidas con 0.4% L-arabinose durante 90 minutos antes de la incubación con destino y soluciones de control y análisis por FACS. Análisis de afinidad para el objetivo de enlace es en caja en rojo. Son diagramas de dispersión de FITC-A vs FSC-A y los valores para las células por ciento obligados (en comparación con el control negativo cerrado incubado con PBS solo) y normalizado intensidad de fluorescencia media (INR, en comparación con el control negativo libre de péptido se incubó con la misma proteína marcada con fluoróforo) de las células inducidas que se incubaron durante 45 minutos con: PBS buffer solo, 150 nM YPet Mona (control positivo para la expresión del péptido) o 250 nM PA-488 (etiquetado como destino). Tenga en cuenta el creciente enriquecimiento en atar afinidad para el destino de interés después de cada ronda de biopanning. En contraste con la figura 3, se completaron todas separaciones celulares de autoMCS usando el programa Posselds. Parte de estos datos también se puede visualizar en los diagramas de dispersión de FITC-H vs H FSC en Sarkes et al. 2015 14 para la comparación a las vs de FITC-A parcelas de la FSC-A se muestra a continuación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: datos de la muestra para el análisis FACS de rondas de clasificación: destino abrax. De manera similar a la figura 2, que se muestra aquí es afinidad comparativa para un experimento biopanning completa, según lo determinado por FACS. La biblioteca de exhibición bacteriana fue sometida a una selección negativa contra las bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina, como en la figura 2, pero luego fue sometida a una ronda adicional de clasificación negativa contra una proteína homóloga con estructura similar y función, rivax, antes de realizar 4 rondas de biopanning positivo para péptidos vinculante para el objetivo, abrax. Para la evaluación de enlace, las células fueron inducidas con 0.4% L-arabinose por 45 min antes de atar a destino, control positivo y control negativo y la lectura en FACS. Afinidad con el objetivo de atar es encajonado en rojo. Son diagramas de dispersión de FITC-A vs FSC-A (o PE-A vs FSC-A en el caso de SAPE) y valores para las células por ciento obligado (en comparación con el control negativo cerrado incubado con PBS solo) e INR de inducida por las células que se incubaron durante 45 minutos con : PBS buffer solo, 150 nM YPet Mona (control positivo para la expresión de péptidos), 250 nM Abrax-488 (destino de la proteína marcada), 250 nanómetro Rivax-488 (etiquetado objetivo potencial de proteína cruz-reactivo), o 250 nM SAPE (control negativo para el atascamiento directo a recubiertas de estreptavidina granos magnéticos). Tenga en cuenta el enriquecimiento cada vez mayor afinidad para el destino de interés, abrax, después de cada ronda de biopanning, y mínima afinidad para la proteína estructural similar, rivax. En contraste con la figura 2, positivo biopanning ronda 1 se realizó mediante el autoMCS programa de Posselds mientras que posteriores rondas de clasificación terminaron utilizando programa de Posseld, sugerido para biopanning en este manuscrito. Estos datos también se pueden visualizar en los diagramas de dispersión de FITC-H vs H FSC en Sarkes et al. 2016 15 para la comparación a las vs de FITC-A parcelas de la FSC-A se muestra a continuación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Análisis de la secuencia de ejemplo utilizando la macro “eCPX_Sequencing” de la salida. Se muestra es una captura de pantalla de 48 colonias secuenciadas de Ronda 4 de biopanning la biblioteca exhibición bacteriana solicitadas para carpetas de PA utilizando el método de Posselds. Aquí se muestra la hoja “Tabla resumen”. Tenga en cuenta que las colonias fueron numeradas en el orden alfabético de su nombre de archivo durante el proceso de secuenciación y que se describen los cuadros de secuencias que se repiten al menos una vez en diferentes colores para el análisis de datos más fácil. La macro eCPX_Sequencing se proporciona como un archivo de código suplementario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: secuencia de determinación de la alineación y el consenso para dos objetivos diferentes proteínas. Todas las imágenes aquí se generaron usando Jalview software con colorante de Clustal_X después de la alineación de secuencias de uso de software de análisis en línea de Kalign 51. A) alineación de repetir secuencias de biopanning PA ronda 4 (corresponde con la tabla 1). B) alineación de repetir secuencias de abrax biopanning redondo 4 (corresponde con la figura 6A). C) alineación de candidatos de top 5 de abrax biopanning redondo 4, según lo determinado por el análisis FACS de candidatos individuales (corresponde con la Figura 6B). La línea roja señala la secuencia consenso en A y C, mientras que la línea púrpura en B subraya el precursor a la secuencia consenso para abrax vinculante al examinar repitiendo secuencias solamente, destacando el potencial necesitan para comprobar la afinidad de Unión usando FACS antes en algunos casos se puede determinar un consenso. Alineaciones similares generados con software de análisis diferentes pueden verse en Sarkes et al. 2015 14 y Sarkes et al. 2016 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: ejemplo enlace afinidad y especificidad para los candidatos individuales analizados mediante FACS. Se muestra aquí es la intensidad de fluorescencia media normalizada (INR) determinada la FACS A) repitiendo secuencias y B) los primeros 5 candidatos, según lo determinado por la afinidad comparativa para el destino, abrax, Ronda 4 biopanning. Los datos representan el promedio (barras) y desviación estándar (barras de error) de tres experimentos de replicación independiente. Tenga en cuenta que todos los candidatos que se muestran son bastante específicos para abrax (barras abrax-488, verdes) sobre una proteína estructural similar, rivax (barras Rivax-488, rojos) y el control negativo de estreptavidina (SAPE, barras negras). Aunque dos de las secuencias de repetición en una (07 AX y AX-15) también entre los candidatos a top 5 en B, comparación de los resultados en A y B demuestra que los análisis de repetir secuencias solo puede no ser suficiente para aislar a los péptidos de afinidad más alta. Datos mostrados aquí fueron adaptados de Sarkes et al. 2016 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1: relación de unión específica para fijación no específica para los candidatos de repetición individuales. En este ejemplo, se muestran el número de secuencias de la repetición y la relación de la PA (objetivo) INR a INR SAPE (control negativo) para las secuencias del candidato repetición de PA biopanning ronda 4. Esta información fue clasificada por la proporción relativa de INR de la nMFI:SAPE del PA y analizada para la presencia del consenso WXCFTC conocido, o una secuencia similar, que se muestra en negrita y subrayada. Tenga en cuenta que las secuencias de auto-organizan, que los candidatos con el consenso tienen el cociente más alto del INR nMFI:SAPE PA y por lo tanto interactúan específicamente con el objetivo. Los resultados que se muestran son de un solo experimento de FACS. Péptidos con menor afinidad para el destino fueron excluidos de las repeticiones adicionales y análisis publicados en Sarkes et al. 2015 14. Suppplemental archivo 1: Haga clic aquí para descargar este archivo. Suppplemental archivo 2: Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Biopanning exhibición bacteriana bibliotecas ha sido un método exitoso para el aislamiento de los reactivos de afinidad, y péptidos ofrecen una alternativa útil a los anticuerpos para el reconocimiento cuando criterios específicos, como la estabilidad en ambientes extremos. Biopanning de estas bibliotecas ha racionalizado mediante los métodos de autoMCS descritos aquí, y una plataforma de autoMCS disponibles en el mercado extiende esta tecnología a un público mucho más amplio. En comparación con la tradicional alternancia MCS/FACS métodos de clasificación de bacterias Mostrar bibliotecas, autoMCS métodos son menos costosos, ya que no requieren inversión en un instrumento más caro de FACS capaz de clasificar y aislar las células consolidadas, en lugar del tipo de citómetro de flujo que se utiliza aquí, que sólo es capaz de análisis ¹⁴. Los pasos críticos para éxito biopanning por autoMCS incluyen selección del programa de separación, clasificación contra potenciales Cruz-reactivos para reducir falsos positivos, control de enriquecimiento de la biblioteca utilizando FACS para determinar cuándo parar biopanning, negativo y análisis inteligente de la piscina del candidato para evitar la engorrosa investigación de centenares de candidatos.

Los ejemplos descritos demuestran biopanning acertado de la biblioteca de exhibición bacteriana solicitadas para dos objetivos separados, PA y abrax, aunque con estrategias de análisis ligeramente diferentes debido a diferencias en las secuencias de péptidos para cada agrupación de candidatos después de cuatro rondas de biopanning. PA fue el caso más sencillo, con análisis de la secuencia que demuestran tendencias claras de las secuencias de péptidos que repite al menos una vez en 144 colonias. Esto solo era suficiente para determinar una secuencia consenso para el objetivo de PA y las colonias que contenía el consenso o una secuencia similar eran los mejores candidatos en cuanto a la proporción de unión a PA frente Unión para el control negativo de estreptavidina. Sin embargo, esto no siempre será el caso. Para el objetivo de abrax, 100 colonias secuencia llevaron a cinco secuencias de repetición pero la tendencia en estas secuencias fue menos clara, que no sea una tendencia a contener residuos de aminoácido aromático y ácido aspártico o asparragina. Predijo el “consenso” de la repetición de secuencias sólo podría han sido producido y probados de afinidad a abrax, pero puesto que ninguna secuencia padres contiene la secuencia consenso exacto, regresamos a la lista de colonias secuenciadas y observa que otros candidatos que tenían más tendencias en común con cada otro. De hecho, dos colonias contienen una secuencia similar al “consenso” de las repeticiones de solas, (FWDTWF en vez de FWAWF), que tenía la misma tendencia de residuos de triptófano, fenilalanina y ácido aspártico, pero con diferente espaciado. Uno de estos péptidos es una secuencia de repetición, no. Estas dos secuencias, junto con una tercera secuencia, que contiene una variante similar, estaban entre los cuadernos top 5 probados en términos de afinidad por abrax. La carpeta superior general, AX-A05, también muestran tendencias similares. Los resultados de abrax demuestran que un enfoque que alterna varias veces entre el análisis de la secuencia y el análisis de afinidad y especificidad a veces será necesario, según el destino elegido. Los resultados para el objetivo de abrax también demuestran el nivel de especificidad que se logra sobre una proteína muy similar (rivax ¹^,¹⁵).

Los programas autoMCS seleccionados para nuestros estudios fueron Posselds y Posseld, ambos de la selección positiva de células blanco etiquetado con baja frecuencia, menos del 5% de la población inicial. En ambos casos, las células pasan por dos columnas magnéticos. En el caso del programa de Posselds, sin embargo, las células pasan más lentamente a través de la primera columna para aumentar el tiempo de exposición ⁴¹. Además de las descripciones del programa dadas por el fabricante del dispositivo de autoMCS comercial (ver la Tabla de materiales) ⁴¹, estos programas fueron escogidos después de una comparación inicial de varios programas potenciales. Capacidad de cada programa para evitar sacar falsos positivos de una cultura homogénea de las células del control negativo y para aislar con éxito una carpeta conocida para un objetivo de interés de una cultura mixta que contiene células de control negativo enriquecidas con una disminución porcentaje de la carpeta conocida, fueron comparados. Si se desvía significativamente de los fines descritos aquí, una comparación similar podría ser útil en la selección del programa de la nueva aplicación. Sin embargo, previamente publicado resultados comparando estos dos programas (Posseld y Posselds) para el aislamiento de péptido reactivos de afinidad para la PA demostrado que usando cualquiera de estos programas para las cuatro rondas de biopanning condujo al aislamiento de péptidos con similares afinidad y especificidad para PA y determinación del consenso de WXCFTC. Las principales diferencias eran Posseld, con su flujo más rápido, ordenado más rápidamente y atar afinidad para el objetivo por lo tanto fue mayor después de sólo dos rondas de biopanning, mientras que usando Posselds condujo a más secuencias únicas después de cuatro rondas de biopanning ¹⁴. aprendiendo de esto, la estrategia cambió ligeramente cuando biopanning para péptidos de enlace abrax incorporar ambos beneficios: Posselds fue utilizado para 1ª ronda para permitir más tiempo de exposición durante esta etapa crítica donde la diversidad es más alta, pero luego la programa fue cambiado a Posseld para el aislamiento rápido de las carpetas de afinidad más alta durante las rondas 2-4 ¹^,¹⁵. Esto parece ideal para abrax, especialmente desde que el INR y Unión fueron más altas para abrax clasificación ronda 4 en comparación con PA ronda 4 con cualquiera de los programas de clasificación (figura 2 figura 3 y Sarkes et al 2015 ¹⁴), pero una comparación directa con una estrategia frente a la otra con el mismo objetivo sería necesaria para una comparación más concluyente. Que programa es mejor para una aplicación particular pueden depender el destino individual, la biblioteca clasificación utilizado y el nivel de expresión de péptidos que se logra con cualquier cambio en las condiciones descritas aquí.

No discutido aquí son resultados potenciales de biopanning con materiales abióticos, pero también hemos usado la misma biblioteca de exhibición bacteriana para biopanning contra bulto de aluminio ². Este estudio no se realizó con autoMCS, pero estudios similares podrían lograrse usando autoMCS si el material está disponible en, o podría recubierto o conjugado con una tira magnética. En el estudio de aluminio a granel, cada aminoácido análisis y modelado de la estructura secundaria fue útil para entender lo que conducía a la afinidad de unión de los péptidos aislados, puesto que ninguna secuencia consenso era determinado ². Incluso con objetivos biológicos, esto puede ser necesario entender lo que está impulsando la afinidad de algunos objetivos, razón por la cual la hoja de cálculo generado por la macro “eCPX_Sequencing” incluye una pestaña con análisis de frecuencia de cada residuo. Si no repiten secuencias se ven además de la falta de un consenso, y frecuencia de residuos no muestra patrón, sin embargo, otros tipos de análisis pueden ser necesarios. Además, puede ser necesario para evitar un mayor número de candidatos para abajo-selección de las personas con afinidad suficiente para el objetivo deseado de detección más rondas de clasificación.

Con la creciente disponibilidad de secuencia de la generación siguiente, podría realizarse un estudio más exhaustivo para determinar a los candidatos más prometedores antes de la prueba de afinidad y para determinar el grado de enriquecimiento después de cada ronda de biopanning. Sin embargo, secuencias de pasar a la etapa de análisis de enlace necesite volver a crear mediante la clonación, si no son de frecuencia lo suficientemente alta para aislar fácilmente con la secuencia habitual Colonia de decenas o cientos de colonias. Esta tecnología avanza, cada vez menos costoso y más habitual, y sobre todo con una opción para el aislamiento de la Colonia, será probablemente sea la mejor forma de analizar datos biopanning. Puede conducir al esclarecimiento de las secuencias de manera individuales y la biblioteca entera, evolucionar. Además, las bacterias en la biblioteca clasificación pueden mutar con el tiempo, lo que podría sesgar la clasificación hacia las células con mayor tasas de crecimiento o bacterias que sobreexpresan proteínas genomic podemos de obligar a un material aún sin mostrar expresión de andamio y péptido, para instancia de. Por esa razón, una vez emergen de candidatos prometedores, cabe aislar el ADN del plásmido, retransforming frescos e. coli y confirmar enlace péptido por FACS. Si va a utilizar el péptido en un formato libre, afinidad también debe ser evaluada para el péptido libre. Por ejemplo, reactivos de afinidad péptido descubiertos a través de exhibición bacteriana para la meta SEB sintéticamente fueron producidos fuera de la célula y analizados por los métodos tradicionales de análisis enzimático ligado a enzimas (ELISA) y en el celular (vía FACS) y fuera de la célula (vía ELISA) afinidad fueron comparadas usando el K_ds determinado por ambos métodos ⁷.

Aunque la fuerza de la interacción biotina-estreptavidina es una estrategia ideal para captura de objetivo de proteína y péptidos consolidados, este procedimiento puede modificarse para otras estrategias de captura. Acoplamiento directo de la proteína de granos magnéticos, tales como epoxi y granos de ácido carboxílico, ha tenido éxito y elimina un paso obligatorio. Sin embargo, conexión directa puede dificultar posibles sitios de unión de una manera específica o no específica, dependiendo de la estrategia de fijación. Una ventaja adicional al uso de granos de estreptavidina es que menos proteína estable objetivos pueden ser recién biotinilado en 30 min o almacenan congelado, si es necesario, mientras que los granos se suelen requerir una incubación más larga con la proteína para cross-linking y son generalmente se almacena a 2-8° C. La concentración inicial sugerida de proteína biotinilada apuntar aquí, 600 nM, ha sido acertado para múltiples objetivos, pero es posible aislar captura reactivos péptido mayor afinidad si esta concentración se reduce. Además, este método puede ser extendido a y modificado para otras bibliotecas de exhibición bacteriana y otros organismos. Por ejemplo, estos pasos pueden realizarse en ausencia de oxígeno para el uso con anaerobios, o en otros ambientes para su uso con extremófilos para aislar péptidos con propiedades únicas. Los péptidos o consenso determinado para un objetivo particular de interés puede ser potencialmente utilizado en la célula como una vida material o producida sintéticamente de la célula. Péptidos producidos sintéticamente pueden ser madurados aún más para el desarrollo de más afinidad y más robustos agentes de proteínas catalizada de captura (PCC) para su uso en sensores, o para otras aplicaciones donde anticuerpos normalmente se utilizaría para el enlace o reconocimiento ³⁸^,⁵⁵. Modelado molecular puede utilizarse también para ayudar a determinar vinculantes, ubicación del péptido con su objetivo, ya que fue realizada recientemente para el abrax péptidos de Unión y consenso aparecen en la figura 5 ¹. General, biopanning exhibición bacteriana bibliotecas para reactivos de afinidad péptido es una alternativa rápida, sencilla y potente para la producción de anticuerpos para el reconocimiento y la detección de dianas de la proteína y esta semi-automatizado biopanning enfoque ha producido resultados fiables con aplicaciones de gran alcance.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean reconocer el apoyo del programa de becas Postdoctoral laboratorio de investigación de los E.E.U.U. ejército (ARL), administrado por Oak Ridge Associated universidades a través de un contrato con ARL, a través de la designación del Dr. Justin P. Jahnke. Restante de financiación fue proporcionada por la dirección de dispositivos de electrónica en ARL y sensores. Los autores también desean agradecer el laboratorio Daugherty en el UCSB para compartir la pantalla bacteriana biblioteca e información para clonar el reactivo YPet Mona, Dr. Bryn Adams para apoyo en la clonación el reactivo YPet Mona a ARL, Dr. Joshua Kogot por su trabajo inicial en y formación en biopanning de exhibición bacteriana bibliotecas, Alena calma del producto químico de Edgewood y centro biológico para el intercambio de plásmidos utilizados para expresar y purificar abrax y proteínas rivax, Brandi Dorsey para la asistencia técnica para el aislamiento de péptidos de enlace PA, Guo Qin para soporte técnico de experimentos preliminares para el aislamiento de péptidos de enlace abrax y Dr. Jessica Terrell para discusiones útiles con respecto a este manuscrito.

Materials

autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545	Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB)	Fisher Scientific	BP1426-500	Growth medium
Chloramphenicol	Fisher BioReagents	BP904-100	Antibiotic
Agar	Fisher Scientific	BP2641-500	Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library	Cytomx Therapeutics	N/A; http://cytomx.com/contact/	On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose	Sigma	A3256-500G	Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)	Amresco	0780-10L	Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh	Thermo Scientific	PI21327	Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit	Thermo Scientific	PI28005	Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads	Invitrogen	65601	Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9647-100G	Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose	Sigma	G8270-1KG	Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona	UCSB and ARL	N/A	Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester	Thermo Scientific	46403	For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)	Thermo Scientific	S866	Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow	Becton, Dickinson, and Company	342003	Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns	Miltenyi Biotech	130-021-101	For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	Miltenyi Biotech	130-091-221	For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution	Miltenyi Biotech	130-092-987	For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol	VWR	E505-4L	Decontamination of autoMACS
Glycerol	Sigma	G6279-1L	For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack	Miltenyi Biotec	130-092-952	For MACS Separation
BD FACSCanto II	Becton, Dickinson, and Company	744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview	For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software	Becton, Dickinson, and Company	659523	For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator	Thermo Scientific	A13346	Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing	Genewiz	N/A; https://www.genewiz.com/	DNA and Colony Sequencing Services
Excel	Microsoft	323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400	For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA)	List Biological Laboratories, Inc.	171	Target protein used as example for representative results.
Abrax	ECBC and ARL	N/A	Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax	ECBC and ARL	N/A	Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

References

Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21 (11), 1504 (2016).
Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25 (33), 4585-4591 (2013).
Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17 (10), 731-739 (2004).
Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 (4), 474-480 (2007).
Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75 (2012).
Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27 (12), 739-745 (2014).
Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. . Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. , (2011).
Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6 (11), e26925 (2011).
Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32 (6), 1484-1494 (2011).
Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. , (2012).
Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21 (7), 435-442 (2008).
Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15 (4), 825-836 (2006).
Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6 (4), 1 (2015).
Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. , (2016).
Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M., Pramatarova, L. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. , 629-642 (2011).
Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7 (009), (2013).
Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5 (12), 1039-1045 (2008).
Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10444-10448 (1993).
Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15 (1), 29-34 (1997).
Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248 (2), 189-198 (2005).
Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66 (1), 10-14 (2000).
Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10 (4), 296-311 (2005).
Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290 (3), 223-230 (2000).
Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28 (9), 766-772 (2001).
Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13 (6), 382-387 (2000).
Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).
Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. , 155-175 (2015).
London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18 (2), 188-199 (2010).
Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the “Living” Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21 (8), 985 (2016).
Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13 (5), 515-523 (2014).
Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22 (6), 843-848 (2011).
Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9 (12), 525-529 (2004).
Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9 (5), 468-477 (2008).
Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2013).
Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. , (2014).
Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. , (2016).
Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79 (5), 2174-2178 (2007).
Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).
Miltenyi Biotec GmbH. . autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. , (2007).
Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8 (11), e80474 (2013).
. . BD FACSCanto II Operator Course Workbook. , (2007).
. . BD FACSCanto II Instructions For Use. , (2007).
Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (2), 156-165 (2012).
. DNA Sequencing Services Available from: https://www.genewiz.com/ (2017)
Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309 (3), 657-670 (2001).
Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7 (1), 539 (2011).
Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6 (1), 298 (2005).
Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20 (3), 426-427 (2004).
Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7 (10), 9452-9460 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

Automatically Generated

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

Automatically Generated

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below