Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

Genotipo codifica el fenotipo ha sido una cuestión importante en la biología desde el redescubrimiento de las leyes de Mendel. Una comprensión de las funciones de los genes, su Reglamento y las interacciones en las redes de genes y las funciones de las promesas de productos codificados para proporcionar herramientas para descubrir nueva biología y mejorando Estados de enfermedad. Para más de la mitad del siglo¹, la rana africana con garras, Xenopus, ha sido un líder modelo para estudios sobre una amplia variedad de temas en biología fundamental y biomedicina, incluyendo el control genético del desarrollo. Históricamente, la investigación en Xenopus ha utilizado la rana tetraploide, X. laevis, pero más recientemente, debido a su Diploidia, X. tropicalis ha sido desarrollado como un modelo genético de anfibios. Se han reunido las secuencias completas del genoma de ambas especies de Xenopus ^2,3. La “comunidad de rana” está ahora en un punto de inflexión donde tecnología de la modificación básica del genoma permite el estudio de la función del gene, prácticamente a voluntad. Endonucleasas CRISPR/Cas9 programables han hecho que la mutagénesis de genes altamente eficientes, con mutación de biallelic posible en la mayoría de las células de los animales^{4,5,6,7, 8,9,10,11}. Estos estudios, puesto de relieve por Bhattacharya et al. ¹² y Shigeta et al. ¹³, han demostrado que la función de muchos genes puede estudiarse mediante mutagénesis en animales de mosaico F₀ . Este enfoque tiene muchas ventajas; sin embargo, los embriones microinyectados Cas9-sgRNA a menudo Mostrar fenotipos variables debido a la incompleta pérdida de la función (LOF). Más significativamente, la generación de líneas mutantes es altamente ventajosa para algunas aplicaciones, en particular, al estudiar los genes que tienen una contribución materna del mRNA. Materna mRNAs y proteínas y sus influencias en la epigenética, persisten durante un período prolongado en embriogénesis^14,15,16, haciendo las aportaciones del desarrollo tempranas de muchos genes refractario a los análisis de₀ F. Por lo tanto, se necesitan otros enfoques LOF.

A la hora crear líneas mutantes, el camino a la obtención de embriones homocigóticos de LOF tiene varios obstáculos. Mutagénesis en primer lugar, eficiente para producir mutaciones biallelic puede ser una desventaja debido a pérdida de las funciones del gen esencial en el fracaso para sobrevivir hasta la madurez sexual, interfiriendo con la producción de una línea viable. Una solución común es la valoración cuidadosa de la cantidad de Cas9-sgRNA entregado. Aquí, el objetivo es lograr un equilibrio entre la reducción de la mortalidad mientras que también maximiza la eficiencia de mutagénesis del germline. Un segundo problema surge a partir del esquema de cría estándar, donde análisis fenotípicos se difieren hasta la generación de₂ F. Utilizando el enfoque estándar, maduran sexualmente animales de₀ F que transmiten a mutante alleles a través de la línea germinal son cruzadas para producir F₁ heterocigoto “portadores”, que luego crecen hasta la madurez sexual. Dos heterocigotos₁ de F entonces se entrecruzan para producir embriones mutantes de F₂ a una frecuencia mendeliana esperada del 25%. Así, dos generaciones de cría son necesarias para el análisis de los fenotipos mutantes. Animales mutantes podrían ser homocigotos o heterocigotos compuestos (es decir, progenie que contiene dos diferentes alelos del mutante, que depende de los genotipos de los padres animales utilizados en los intercross de₁ F).

Estos obstáculos pueden superarse por confinamiento programable mutagénesis mediada por la nucleasa a las células de germen, que es la base de un nuevo método llamado saltar¹⁷. Leapfrogging tiene dos componentes principales: (1) la microinyección de mRNA Cas junto con sgRNA o nucleasa-sgRNA complejos (o de las nucleasas de dedos de principio, TALENs o zinc) en la etapa unicelular a eficientemente mutagenize genoma embrionario, seguido por (2) el trasplante de PGCs en embriones de tipo salvaje hermano, donde se eliminaron las PGCs endógenas. Puede obtenerse cuando ambos pasos son reemplazo del germline eficiente, completo con las células de germen mutantes. Blackler demostró en la década de 1960 que Xenopus PGCs podrían trasplantarse entre embriones con la neurula tarde y temprano tailbud etapas^18,19. Para leapfrogging, enfoque de Blackler fue modificada mediante la realización de los trasplantes en el blastula etapa¹⁷, cuando PGCs se localizan en el polo vegetal del embrión^20,21. Trasplante antes de la gastrulación tiene dos ventajas principales. En primer lugar, el engraftment de trasplantes y el posterior desarrollo normal fue encontrado para ser más eficiente cuando el trasplante se realiza en la fase de blástula (observaciones no publicadas). En segundo lugar, realizando trasplantes de blastula etapa poco después transcripción cigóticos ha comenzado, uno puede evitar la letalidad resultantes del desarrollo gene mutaciones que afecten la gastrulación u originar malformaciones neurulae finales. PGC trasplante-cojinete (“saltaba”) embriones son cultivados a la madurez sexual, y intercrosses entre estos F₀ de animales han demostrado que, en muchos casos, 100% de la progenie de₁ F muestran el fenotipo LOF (la mayoría siendo compuesto los heterocigotos), indicando la sustitución completa del germline con mutaciones específicas.

Se espera que evitamos acelerará enfoques genéticos en Xenopus. Evitamos también proporciona una alternativa al método de “transferencia de acogida”²² para el análisis de genes de efecto materno (observaciones no publicadas) de LOF. En la publicación actual, se presenta una descripción detallada del método, centrándose especialmente en el trasplante del PGC, en X. tropicalis (con pequeñas modificaciones para X. laevis). El trasplante de PGCs se demuestra aquí para facilitar a una transferencia más rápida de esta tecnología a otros laboratorios que trabajan con Xenopus. Los principios de este método deben ser exitosos en otros anfibios (e.g., tritones), y específicas del organismo modificaciones en la metodología deben permitir para el uso de muchos otros animales en el que se puede lograr eficiente mutagénesis y PGCs son fácilmente transplantables.