Первичных зародышевых клеток Трансплантация для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-основе скачка в Xenopus

Как генотип кодирует фенотип был основной вопрос в биологии с момента повторного законов Менделя. Понимание роли генов, их регулирования и взаимодействия в рамках генных сетей и функции закодированные продуктов обещания предоставить инструменты для выявления новой биологии и совершенствуясь болезни государства. Для более чем половины столетия¹африканских когтистые лягушка Xenopus, был ведущим модель для исследования на самые разнообразные темы в базовой биологии и биомедицины, включая генетического контроля развития. Исторически большинство исследований по Xenopus использовала интрогрессии лягушка, X. laevis, но совсем недавно, благодаря своей diploidy, X. tropicalis был разработан как амфибии генетической модели. Полный геном последовательности были собраны от обоих видов Xenopus ^2,3. «Лягушка сообщества» является теперь в поворотный момент где основные генома модификации технологии позволяет исследование функции гена, практически на волю. Программируемый ТРИФОСФАТЫ/Cas9 эндонуклеазами сделали мутагенез генов высокоэффективных, с biallelic мутации возможно в большинстве клеток животных^{4,5,6,7, 8,9,10,11}. Эти исследования, подчеркнул Бхаттачарья и др. ¹² и Шигета и др. ¹³, показали, что функции многих генов может быть изучен мутагенеза в F₀ мозаика животных. Этот подход имеет множество преимуществ; Однако Cas9-sgRNA-microinjected эмбрионы часто отображения переменной фенотипов из-за неполной потери функции (LOF). Более значительно, поколение мутантных линий является весьма выгодным для некоторых приложений — в частности, при изучении генов, которые имеют материнской вклад мРНК. Матери мРНК и белки и их влияния на epigenetics, сохраняются для длительного периода в эмбриогенезе^14,15,16, предоставление раннего развития вклад многих генов Огнеупорные материалы для F₀ анализы. Таким образом необходимы другие подходы LOF.

При поиске для создания мутантных линий, путь для получения гомозиготных LOF эмбрионы есть несколько препятствий. Во-первых, эффективное мутагенеза производить biallelic перегласовок может быть невыгодно, поскольку потеря функций важно генов приводит к сбою дожить до половой зрелости, мешая производства жизнеспособных линии. Общее решение является тщательное титрования количество доставлены Cas9-sgRNA. Здесь цель – добиться баланса между снижение летальности также максимизируя эффективность мутагенеза микрофлорой. Вторая проблема возникает от стандартного разведения схемы, где фенотипические анализы откладываются до F₂ поколения. Используя стандартный подход, сексуально зрелых F₀ животных, которые передают мутант аллели через микрофлорой outcrossed для производства F₁ гетерозиготных «носители», которые затем выросла до половой зрелости. Два F₁ heterozygotes затем intercrossed производить F₂ черепашки эмбрионов на ожидаемый Менделевское частоте 25%. Таким образом два поколения размножения необходимых для анализа мутант фенотипов. Мутанта животных может быть рецессивной или составные heterozygotes (т.е., потомства содержащий два разных мутантные аллели, которая зависит от генотипы родителей животных, используемых в Интеркросс₁ F).

Эти препятствия могут быть преодолены, ограничивая программируемые нуклеиназы опосредованной мутагенеза в зародышевых клеток, которая лежит в основе новый метод под названием скачок¹⁷. Скачка имеет два основных компонента: (1 микроинъекции мРНК Cas вместе с sgRNA, или нуклеиназы sgRNA комплексов (или, в принципе, Таленс или цинка палец nucleases) на стадии одноклеточных, эффективно mutagenize эмбриональных геномов, следуют (2) Трансплантация PGCs в wildtype сестру эмбрионов, где эндогенного PGCs были удалены. Когда оба шаги являются эффективным, полный микрофлорой замена мутант зародышевые клетки могут быть получены. Blackler в начале 1960-х годов показал, что Xenopus PGCs могут быть трансплантированы между эмбрионов в конце Нейрула и раннего tailbud этапов^18,19. Для скачка, Blackler подход был изменен путем выполнения пересадки на стадии Бластула¹⁷, когда PGCs локализованы в растительный полюс эмбриона^20,21. Трансплантация перед гаструляция имеет два основных преимущества. Во-первых приживления трансплантатов и последующего нормального развития было установлено быть более эффективным, когда Трансплантация проводится на этапе Бластула (неопубликованные наблюдения). Во-вторых выполняя Бластула этап трансплантаций вскоре после того, как началась zygotic транскрипции, можно избежать летальность, вытекающие из развития генных мутаций, которые нарушают гаструляция или что в противном случае привести к искаженной конце neurulae. PGC трансплантации подшипник («leapfrogged») эмбрионов выращиваются для половой зрелости, и intercrosses между этими животными₀ F показали, что во многих случаях 100% F₁ потомства отображения LOF фенотипу (большинство из них составные heterozygotes), указав полный микрофлорой замена с целевой мутации.

Ожидается, что скачок ускорит генетических подходов в Xenopus. Прорыва также предоставляет альтернативу «хозяин передачи» метод²² для анализа LOF гены материнского эффекта (неопубликованные наблюдения). В текущей публикации подробное описание метода, особенно упором на трансплантации PGC, представлен в X. tropicalis (с незначительными изменениями на X. laevis). Трансплантация PGCs продемонстрировали здесь для облегчения более быстрой передачи этой технологии других лабораторий, работающих с Xenopus. Принципы этого метода должен быть успешными в других амфибий (например, urodeles), и организм конкретных изменений в методологии следует предусматривать приложения для многих других животных, в которых может быть достигнуто эффективное мутагенеза и PGCs легко которые спасаютжизньпритрансплантации.