Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

Como genótipo codifica o fenótipo tem sido uma grande questão em biologia desde a redescoberta de leis de Mendel. Uma compreensão das funções dos genes, sua regulação e interações nas redes do gene e as funções das promessas de produtos codificado para fornecer ferramentas para descobrir nova biologia e melhorar Estados de doença. Para mais de meio século¹, a africana Xenopus, Xenopus, tem sido um líder modelo para estudos sobre uma grande variedade de tópicos em biologia básica e biomedicina, incluindo o controle genético do desenvolvimento. Historicamente, a maioria das pesquisas sobre Xenopus tem usado o sapo allotetraploid, X. laevis, mas mais recentemente, devido à sua Diploidia, X. tropicalis desenvolveu-se como um modelo genético de anfíbios. Foram montadas sequências do genoma completo de ambas as espécies de Xenopus ^2,3. A comunidade de”sapo” é agora um ponto de viragem onde tecnologia de modificação do genoma básicos permite o estudo da função do gene, praticamente à vontade. Programável CRISPR/Cas9 endonucleases fizeram o mutagenesis de genes altamente eficiente, com biallelic mutação possível na maioria das células do animal^{4,5,6,7, 8,9,10,11}. Estes estudos, sublinhados por Bhattacharya et al ¹² e Shigeta et al ¹³, têm mostrado que a função de muitos genes pode ser estudada por mutagênese em animais de mosaico F₀ . Esta abordagem tem muitas vantagens; no entanto, Cas9-sgRNA-injetadas embriões frequentemente exibem fenótipos variáveis devido a perda incompleta da função (LOF). Mais significativamente, a geração de linhas mutantes é altamente vantajosa para alguns aplicativos — em especial, ao estudar os genes que têm uma contribuição materna do mRNA. MRNAs maternos e proteínas e suas influências na epigenética, persistirem por um período prolongado na embriogênese^14,15,16, tornando as contribuições do desenvolvimento precoce de muitos genes refratários para análises de F₀ . Portanto, outras abordagens LOF são necessárias.

Quando pretendem criar linhas mutantes, o caminho para obtenção de embriões LOF homozigotos tem vários obstáculos. Mutagênese em primeiro lugar, eficiente para produzir mutações biallelic pode ser desvantajoso porque a perda das funções essenciais do gene resulta em falha para sobreviver à maturidade sexual, interferindo com a produção de uma linha viável. Uma solução comum é a titulação cuidadosa da quantidade de Cas9-sgRNA entregado. Aqui, o objetivo é alcançar um equilíbrio entre reduzir letalidade enquanto também maximiza a eficiência de mutagénese germline. Um segundo problema surge a partir do esquema de reprodução padrão, onde análises fenotípicas são diferidas até à geração₂ de F. Usando a abordagem padrão, sexualmente maduras animais de₀ F que transmitem mutante alelos através do germline são outcrossed para produzir F₁ heterozigoto “transportadoras”, que em seguida são cultivadas para a maturidade sexual. Dois heterozigotos de₁ F são então intercrossed para produzir embriões mutantes de F₂ com uma frequência mendeliana esperada de 25%. Assim, duas gerações de reprodução são necessárias para a análise de fenótipos mutantes. Animais mutantes poderiam ser homozigotos ou heterozigotos compostos (ou seja, a descendência que contém dois alelos mutantes diferentes, que depende dos genótipos dos animais parentais utilizados em intercross de₁ a F).

Estes obstáculos podem ser superados por confinar programável mediada por nuclease mutagênese de células germinativas, que está subjacente a um novo método chamado saltando¹⁷. Saltos tem dois componentes principais: (1) a microinjeção de mRNA Cas juntamente com sgRNA, ou sgRNA-nuclease complexos (ou, em princípio, TALENs ou zinco nucleases de dedo) na fase de célula única para eficientemente mutagenize embrionárias genomas, seguido por (2) o transplante de PGCs em embriões de sua irmã, onde os PGCs endógenos foram removidos. Quando os dois passos são germline eficiente, completa substituição com mutantes de células germinativas pode ser obtido. Blackler demonstrado na década de 1960 que Xenopus PGCs poderiam ser transplantadas entre embriões no neurula atrasado e cedo tailbud fases^18,19. Para saltos, abordagem do Blackler foi modificada por realizar os transplantes para o estágio de blástula¹⁷, quando PGCs são localizadas no polo vegetal do embrião^20,21. Transplante antes gastrulação tem duas vantagens principais. Primeiro, a enxertia de transplantes e o subsequente desenvolvimento normal foi encontrada para ser mais eficiente quando o transplante é realizado na fase de blástula (observações não publicadas). Em segundo lugar, realizando transplantes de blástula-palco logo após a transcrição zigóticos começou, um pode evitar a letalidade decorrentes do desenvolvimento gene mutações que interrompem a gastrulação ou que caso contrário levar ao neurulae tarde malformado. PGC transplante-rolamento (“leapfrogged”) embriões são cultivados a maturidade sexual, e inter-cruzamentos entre estes animais de₀ F têm demonstrado que, em muitos casos, 100% da descendência F₁ exibir o fenótipo LOF (a maioria sendo composto heterozigotos), indicando a substituição completa do germline com as mutações específicas.

Espera-se que saltos acelerará abordagens genéticas em Xenopus. Saltos também fornece uma alternativa para o método de “transferência de acolhimento”²² para a análise LOF dos genes maternos-efeito (observações não publicadas). Na atual publicação, uma descrição detalhada do método, concentrando-se especialmente na transplantação de PGC, é apresentada em X. tropicalis (com pequenas modificações para X. laevis). O transplante de PGCs é demonstrado aqui para facilitar uma mais rápida transferência desta tecnologia para outros laboratórios que trabalham com Xenopus. Os princípios deste método devem ser bem sucedidos em outros anfíbios (por exemplo, urodeles), e modificações do organismo específico na metodologia permitir aplicação para muitos outros animais na qual mutagênese eficiente pode ser realizado e PGCs são prontamente para transplante.