アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植
Summary
生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null 変異体の効率的な生成ができます。ここでは、移植の手順が示されています。
Abstract
ゲノム編集による突然変異系統の作成は多くの有機体の遺伝解析を加速しています。CRISPR/Cas9 方法は、アフリカツメガエル、アフリカツメガエル、生物医学研究のための長年のモデル有機体の使用のために適応されています。CRISPR/Cas9 標的突然変異のホモ接合体の突然変異系統を作成するための伝統的な育種方式があるいくつかの時間がかかり、骨の折れる手順。特に、胚形成に不可欠な遺伝子をノックアウトに関連付けられている障害を克服するために突然変異体の胚の作成を容易にするには、リープフロッギングと呼ばれる新しい方法を開発しました。この手法は「カットアンド ペースト「アフリカツメガエル胚の堅牢性を活用して胎生学的方法。リープフロッギング PGC アブレーション野生型兄弟に効率的に突然変異誘発ドナー胚から始原生殖細胞 (PGCs) の伝達を利用します。このメソッドは、必須遺伝子の効率的な変異の変異の生殖細胞を運ぶ野生型細胞とキメラ動物を作成することによってできます。ときを運ぶ 2 つの F0動物」を抜いて移植」(すなわち、突然変異体生殖細胞) を intercrossed、彼ら胚を作り出すホモ、または複合ヘテロ接合体、null F1 、そのため表現型データを取得する完全な生成時間節約します。F0表現型解析 CRISPR/Cas9 変異を次に不応性である母性効果遺伝子を解析するための新しいアプローチを示しますもリープフロッギングします。この原稿は、リープフロッギング、PGC 移植を正常に実行する方法に特別な重点を置いての方法を詳しく説明します。
Introduction
遺伝子型が表現型にエンコードし、メンデルの法則の再発見から生物学の主要な質問がされています。発掘の新しい生物学および従って, これらの疾患状態のツールを提供するためにエンコードされた製品約束の機能と遺伝子、その調節と遺伝子ネットワークの相互作用の役割の理解。半分以上世紀1アフリカツメガエル、アフリカツメガエルは、基礎生物学、生物医学、開発の遺伝制御を含むさまざまなトピックに関する研究の主要なモデルをされています。歴史的に、アフリカツメガエルのほとんどの研究は、allotetraploid カエル、 X. laevisを使用しているが、最近では、その二倍体遺伝のために、 X. tropicalisを両生類遺伝モデルとして開発されています。全ゲノム配列は、両方アフリカツメガエル種2,3から組み立てされています。「カエルのコミュニティ」は基礎ゲノム改質技術が許可されている遺伝子機能の研究事実上はターニング ポイントで今です。プログラマブル CRISPR/Cas9 酵素からの遺伝子の突然変異を誘発した非常に効率的に、シュミレーション可能な大部分の細胞の変異動物4,5,6,7、 8,9,10,11。バッタチャリヤらによって強調したこれらの研究12重田ら13F0モザイク動物の突然変異誘発による多くの遺伝子の機能を学ぶことができることが示されています。このアプローチは多くの利点;ただし、Cas9 sgRNA microinjected 胚はしばしば関数 (LOF) の不完全な損失のため変数表現型を表示します。大きくなり、突然変異系統の生成は、いくつかのアプリケーションのため、非常に有利、特に母性 mRNA 貢献をしている遺伝子の研究の際に。母性 Mrna とタンパク質とエピジェネティクス、胚発生14,15,16、多くの遺伝子の早期発達貢献をレンダリング長時間にわたって永続化します。F0解析する耐火物。したがって、他の LOF のアプローチが必要です。
突然変異系統を作成しようとすると、ホモの LOF の胚を取得するパスはいくつかの障害には。必須な遺伝子機能の損失結果として生き残るために性的に成熟、現実的なラインの生産と干渉する障害シュミレーションの突然変異を生成する最初、効率的な変異が不利なるです。一般的なソリューションは、Cas9 sgRNA の配信量の慎重な滴定です。ここでは、目的はまた生殖細胞系突然変異誘発効率を最大化しながら致死率を減らすことの間のバランスを達成するためにです。2 番目の問題は、表現型解析が F2世代まで遅延される標準的な育種方式から発生します。標準的なアプローチを使用すると、性的成熟する F0動物生殖細胞を通じて対立遺伝子が F1ヘテロ「キャリア」が、性的な成熟に成長して生成する outcrossed 変異体を送信します。2 F1ヘテロ接合体は、25% の期待されるメンデル頻度で F2変異胚を作り出すため、intercrossed します。したがって、繁殖の二世代が突然変異体の表現型解析のため必要です。変異動物は、急性または複合ヘテロ接合体 (すなわち、子孫含む 2 つの異なる変異対立遺伝子、F1エムアンドエー インター クロスにおける親動物の遺伝子型に依存する) 可能性があります。
これらの障害は、プログラマブル ヌクレアーゼを介した突然変異誘発による生殖細胞、馬跳び17と呼ばれる新しいメソッドの基礎となる拘束で克服できます。2 つの主要コンポーネントがありますリープフロッギング: (1) 一緒に sgRNA、またはヌクレアーゼ sgRNA 錯体 (または原則、TALENs または亜鉛指核酸) Cas mRNA マイクロインジェクション (2) 続いて胚性ゲノムを効率的に mutagenize に単一細胞の段階でPGCs の内因性の PGCs が削除された、野生型の兄弟の胚への移植。両方の手順が突然変異体の生殖細胞を効率的で、完全な生殖系列の置換を取得できます。Blackler は、後半 neurula で胚と早く尾段階18,19アフリカツメガエル始原生殖を移植できれば、1960 年代初頭に示した。リープフロッギングの Blackler のアプローチは、胞胚のステージ17で移植胚20,21の植物極の PGCs がローカライズされる場合を実行することによって変更されました。原腸陥入前に移植には 2 つの主な利点。まず、移植とそれに続く正常な発達の生着は (未発表観察) 胞胚の段階で移植するときより効率的なことが判明しました。第二に、ココヤシの転写の開始後まもなく、胞胚期移植を実行する、不正な後半 neurulae に導いてくれる原腸陥入を混乱させる変異進化の遺伝子から生じる致死避けることが 1 つ。PGC 移植軸受 (「アベンテイル」) 胚が性的に成熟、成長、これら F0動物間の intercrosses は、F1子孫の 100% は多くのケースで、LOF 表現型 (ほとんどされている化合物も表示を示しています。ヘテロ接合体)、対象となる遺伝子変異を有する完全な生殖系列の置換を示します。
リープフロッギングアフリカツメガエルの遺伝的アプローチを加速する予定です。22 「ホスト転送」メソッドに代わるは母性効果遺伝子 (未発表観測) の LOF の分析も、飛び越えて.現在の文書では、PGC 移植中心メソッドの詳細な説明はX. tropicalisで (、 X. laevisに変更を加える) されます。PGCs の移植は、アフリカツメガエルの使用他の所により迅速な技術移転を容易にする紹介です。この方法の原理は他の両生類 (例えば有尾) に成功したする必要があり、効率的な変異を実現する他の多くの動物への応用方法論で生物固有の変更を許可し、PGCs が容易に移植できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このレポート提供中動物の生殖細胞を変更する PGCs。 移植の PGCs を含む植物性の組織移植のための詳しいプロトコルはゲノム編集技術 (例えばCRISPR/Cas9) と組み合わせて使用遺伝子野生型としてその体細胞組織のほぼすべてを維持します。成功するリープフロッギングの行う移植を実行する前に考慮すべき重要な要因の数があります。
生殖細胞の突然変異体の対立?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、助成金の支援を受けて行われた 5R21HD080684-02、国立小児保健と人間開発から。著者は彼の継続的な熱意と支援の県町をお礼申し上げます。著者とも認めるしたいブルース ・ ブランバーグ彼のカメラ、リベカ チャーニー、原稿とショーン · マクナマラ、Marcin Wlizla 国立アフリカツメガエルリソース (RRID:SCR_013731) での重要な読書のための使用のための貴重なX. tropicalisの餌と動物の治療法についての会話。
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. . L’origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. . Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).
- Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D’Alessio, J. M., O’Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
