Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

Come genotipo Codifichi il fenotipo è stata una domanda importante nella biologia dato che la riscoperta delle leggi di Mendel. Una comprensione dei ruoli dei geni, la loro regolazione e interazioni all’interno di reti geniche e le funzioni delle promesse di prodotti codificati per fornire strumenti per scoprire nuova biologia e miglioramento degli Stati di malattia. Per oltre mezzo secolo¹, la Rana artigliata africana, Xenopus, è stato un modello di punta per gli studi su una vasta gamma di argomenti in biologia di base e la biomedicina, compreso il controllo genetico dello sviluppo. Storicamente, la maggior parte della ricerca su Xenopus ha utilizzato la rana allotetraploide, X. laevis, ma più recentemente, a causa della sua diploidia, X. tropicalis è stato sviluppato come un modello genetico di anfibio. Sequenze di genoma completo sono stati assemblati da entrambi Xenopus specie^2,3. La “comunità di rana” è ora a un punto di svolta dove tecnologia modifica base genoma permette lo studio della funzione genica, praticamente a volontà. Programmabile CRISPR/Cas9 endonucleasi hanno reso la mutagenesi di geni altamente efficiente, con mutazione biallelica possibile nella maggior parte delle cellule di animali^{4,5,6,7, 8,9,10,11}. Questi studi, sottolineati dalla Bhattacharya et al. ¹² e Shigeta et al. ¹³, hanno dimostrato che la funzione di molti geni possa essere studiata mediante mutagenesi in animali di mosaico₀ F. Questo approccio ha molti vantaggi; Tuttavia, gli embrioni Cas9-sgRNA-microiniettati visualizzano spesso fenotipi variabili a causa di incompleta perdita di funzione (LOF). Più significativamente, la generazione di linee mutanti è estremamente vantaggiosa per alcune applicazioni — in particolare quando lo studio di geni che hanno un contributo di mRNA materno. Materna mRNA e proteine e le loro influenze su epigenetica, persistono per un periodo prolungato nell’embriogenesi^14,15,16, rendendo i primi contributi inerenti allo sviluppo di molti geni refrattario alle analisi₀ F. Pertanto, sono necessari altri approcci LOF.

Quando si cerca di creare linee mutanti, il percorso per ottenere embrioni LOF omozigotici ha diversi ostacoli. Mutagenesi in primo luogo, efficiente per produrre mutazioni bialleliche può essere svantaggiosa perché perdita delle funzioni dei geni essenziali esito negativo per sopravvivere alla maturità sessuale, interferendo con la produzione di una linea vitale. Una soluzione comune è la titolazione attenta della quantità di Cas9-sgRNA consegnato. Qui, l’obiettivo è raggiungere un equilibrio tra la riduzione di mortalità anche massimizzando l’efficienza di mutagenesi di germline. Un secondo problema nasce dallo schema standard di allevamento, dove analisi fenotipiche vengono posticipate fino alla generazione₂ F. Utilizzando l’approccio standard, sessualmente maturi animali₀ F che trasmettono mutante alleli attraverso la linea germinale sono esogamico per produrre F₁ “eterozigoti”, che poi sono cresciute alla maturità sessuale. Due heterozygotes di₁ F sono poi incrociate per produrre embrioni mutanti di F₂ a una frequenza di Mendelian prevista del 25%. Due generazioni di allevamento sono quindi necessari per l’analisi dei fenotipi mutanti. Animali mutanti potrebbero essere omozigoti o eterozigoti composti (cioè, progenie contenente due alleli differenti del mutante, che dipende i genotipi di animali parentali utilizzati per il re di₁ F).

Questi ostacoli possono essere superati da confinare programmabile mutagenesi nucleasi-mediata delle cellule di germe, che è alla base di un nuovo metodo denominato rincorsa¹⁷. Rincorsa ha due componenti principali: (1) la microiniezione di mRNA Cas insieme sgRNA o nucleasi-sgRNA complessi (o, in linea di principio, TALENs o zinco nucleasi a dita) allo stadio unicellulare da mutagenizzare efficientemente genoma embrionale, seguito da (2) il trapianto di PGC negli embrioni di pari livello wildtype, dove sono stati rimossi il PGC endogeno. Quando entrambi i passaggi sono la sostituzione di germline efficiente, completo con le cellule germinali mutante può essere ottenuta. Blackler dimostrata nei primi anni 1960 che Xenopus PGC potrebbe essere trapiantati tra embrioni alla neurula ritardato e presto tailbud fasi^18,19. Per salto, approccio di Blackler modifica eseguendo i trapianti blastula fase¹⁷, quando PGC sono localizzati nel palo vegetal del embrione^20,21. Il trapianto prima gastrulazione ha due vantaggi principali. In primo luogo, l’attecchimento di trapianti e il successivo sviluppo normale è stato trovato per essere più efficiente quando il trapianto viene effettuato nella fase di blastula (osservazioni non pubblicate). In secondo luogo, eseguendo trapianti blastula-fase poco dopo trascrizione zygotic è iniziata, si può evitare la letalità derivanti dal gene inerente allo sviluppo mutazioni che interrompono la gastrulazione o che altrimenti portano a neurulae fine non valido. PGC trapianto-cuscinetto (“scavalcati”) gli embrioni sono cresciuti alla maturità sessuale, e intercrosses tra questi animali₀ F hanno dimostrato che, in molti casi, il 100% della prole F₁ Visualizza il fenotipo LOF (la maggior parte essendo composto eterozigoti), che indica di germline completa sostituzione con le mutazioni mirate.

Si prevede che la rincorsa accelererà approcci genetici in Xenopus. Anche scavalcando fornisce un’alternativa al metodo “ospitare trasferimento”²² per l’analisi LOF di geni effetto materno (osservazioni non pubblicate). Nella pubblicazione corrente, una descrizione dettagliata del metodo, concentrandosi soprattutto sul trapianto di PGC, è presentata in X. tropicalis (con modifiche minori per X. laevis). Il trapianto di PGC è dimostrato qui per facilitare un più rapido trasferimento di questa tecnologia ad altri laboratori lavorando con Xenopus. I principi di questo metodo dovrebbero essere successo in altri anfibi (ad es., urodeli), e le modifiche di organismo-specific nella metodologia dovrebbero consentire per applicazione a molti altri animali in cui è possibile mutagenesi efficiente e PGC sono prontamente transplantable.