השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

איך מקודד גנוטיפ פנוטיפ כבר שאלה גדולה בביולוגיה מאז גילויה מחדש של חוקי מנדל. הבנה של התפקידים של גנים, רגולציה שלהם ואינטראקציות בתוך רשתות ג’ין, הפונקציות של מוצרים מקודד הבטחות כדי לספק כלים עבור חשיפת ביולוגיה חדש ועם מצבי מחלה ameliorating. במשך יותר מחצי מאה¹, הצפרדע שנחטף ייזרק אפריקאי, צפרדע רפואית, כבר דוגמנית מובילה ללימודי במגוון רחב של נושאים בסיסיים בביולוגיה, וההתערבות, כולל הבקרה הגנטית של פיתוח. מבחינה היסטורית, רוב המחקרים על צפרדע רפואית השתמשה הצפרדע allotetraploid, X. laevis, אך לאחרונה, בשל diploidy שלה, X. tropicalis פותחה כמודל גנטי דו-חיים. רצף הגנום המלא יש הורכב מ^2,שני מינים צפרדע רפואית ³. “קהילה צפרדע” הוא עכשיו נקודת מפנה שבו הגנום בסיסי שינוי הטכנולוגיה מאפשרת המחקר של תפקוד הגן, כמעט כרצונו. Endonucleases CRISPR/Cas9 לתכנות הפכו את מוטגנזה מכוונת של גנים יעילים ביותר, עם biallelic מוטציה אפשרית בתאים רוב של בעלי חיים^{4,5,6,7, 8,9,10,11}. מחקרים אלה, על-ידי Bhattacharya. et al. ¹² ו. Shigeta et al. ¹³, הראו כי הפונקציה של גנים רבים ניתן יהיה ללמוד על ידי מוטגנזה מכוונת בבעלי פסיפס של F₀ . גישה זו יש יתרונות רבים; עם זאת, Cas9-sgRNA-microinjected עוברי מוצג לרוב פנוטיפים משתנה בשל אובדן לא שלם של פונקציה (LOF). יותר באופן משמעותי, של קווים מוטציה הדור יש יתרון מאוד עבור יישומים מסוימים — בפרט לומדים גנים בעלי תרומה mRNA אימהית. MRNAs האימהי ואת החלבונים והשפעות שלהם על אפיגנטיקה, נמשכות לתקופה ממושכת לתוך מופרה^14,15,16, מתן תרומות התפתחותי מוקדם של גנים רבים חסיני אש ל F₀ ניתוחים. לכן, גישות אחרות LOF נדרשים.

כאשר המבקשים ליצור קווים מוטציה, הדרך להשגת עוברי LOF homozygous יש מספר מכשולים. מוטגנזה מכוונת הראשון, יעיל לייצר מוטציות biallelic יכול להיות חסרון כי אובדן של גנים חיוניים פונקציות התוצאה היא כשל כדי לשרוד עד לבגרות מינית, הפרעה בייצור קו קיימא. פתרון משותף הוא טיטרציה זהירה של כמות Cas9-sgRNA משלוח. כאן, המטרה היא להשיג איזון בין הפחתת lethality תוך מיקסום גם germline מוטגנזה מכוונת יעילות. בעיה נוספת נובעת ערכת גידול רגיל, איפה ניתוחים פנוטיפי הם נדחים עד הדור₂ F. באמצעות גישה סטנדרטי, בוגרת מינית F₀ חיות המעבירים מוטציה אללים דרך germline הם outcrossed כדי לייצר F₁ “שירות heterozygous”, אשר לאחר מכן גדלים לבגרות מינית. שני F₁ heterozygotes הם intercrossed ואז לייצר F₂ עוברים מוטציה בתדר Mendelian הצפויה של 25%. לכן, שני דורות של רבייה נחוצים לצורך ניתוח של פנוטיפים מוטציה. חיות יכול להיות homozygotes או תרכובת heterozygotes (קרי, כשהיא המכיל שני אללים mutant שונים, תלוי אחרים של החיות הורים המשמשים את intercross₁ F).

מכשולים אלה ניתן להתגבר על ידי כליאת לתכנות בתיווך נוקלאז מוטגנזה מכוונת לתאי נבט, המונחת שיטה חדשה הנקראת קפיצת מדרגה¹⁷. קפיצת מדרגה מכיל שני רכיבים מרכזיים: (1) microinjection של mRNA Cas יחד עם sgRNA, או קומפלקסים נוקלאז-sgRNA (או, עקרון, TALENs או אבץ אצבע nucleases) בשלב תא בודד כדי ביעילות mutagenize הגנום העוברי, ואחריו (2) השתלת של PGCs לתוך wildtype עוברי אח, איפה PGCs אנדוגני הוסרו. ניתן להשיג בשני שלבים את מועד החלפת germline יעילה, להשלים עם מוטציה בתאי הנבט. Blackler הפגינו בשנות ה-60 המוקדמות כי יכול להיות מושתלים צפרדע רפואית PGCs בין עוברי-neurula מאחר מוקדם tailbud שלבים^18,19. עבור קפיצת מדרגה, הגישה של Blackler שונתה על-ידי ביצוע של השתלות על הבמה blastula¹⁷, כאשר PGCs מותאמים במוט vegetal^20,עובר²¹. השתלת לפני gastrulation יש שני יתרונות עיקריים. קודם כל, engraftment של השתלות, להתפתחות תקינה לאחר מכן נמצאה כדי להיות יעיל יותר כאשר השתלת מבוצע בשלב blastula (שלא פורסמו תצפיות). שנית, על ידי ביצוע השתלות blastula-שלב זמן קצר לאחר תחילת שעתוק zygotic, אחד לא יכול למנוע את הקטלניות הנובעים ג’ין התפתחותית מוטציות לשבש gastrulation או אחרת להוביל neurulae מאוחר בעלת מבנה פגום. עוברי (“עד”) השתלת מניבי PGC בוגרים לבגרות מינית, intercrosses בין בעלי חיים אלה F₀ הדגימו כי, במקרים רבים, 100% צאצאים₁ F להציג את פנוטיפ LOF (רוב להיות מורכבים heterozygotes), המציינת את החלפת germline להשלים עם מוטציות יישוב.

הוא צפוי כי קפיצת מדרגה נאיץ את גישות גנטיות בצפרדע רפואית. קפיצת מדרגה גם מספק אלטרנטיבה שיטת “לארח העברה”²² לניתוח LOF של גנים אמהי-אפקט (שלא פורסמו תצפיות). בפרסום הנוכחי, מוצג תיאור מפורט של השיטה, במיוחד התמקדות PGC ההשתלה, X. tropicalis (עם שינויים מזעריים עבור X. laevis). ההשתלה של PGCs הוא הפגין כאן כדי להקל על העברה מהירה יותר של טכנולוגיה זו למעבדות אחרות לעבוד עם צפרדע רפואית. עקרונות שיטה זו צריכה להיות מוצלחת דו-חיים אחרים (למשל, urodeles), וגם שינויים האורגניזם הספציפי של המתודולוגיה צריכה מאפשרים ליישום חיות רבות אחרות שבהן מוטגנזה מכוונת יעיל יכול להתבצע, PGCs הם ברצון שיפותחו.