Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus

Comment le génotype encode phénotype a été une question majeure en biologie depuis la redécouverte des lois de Mendel. Comprendre les rôles des gènes, leur régulation et interactions au sein des réseaux de gènes et les fonctions des promesses de produits codés de fournir des outils pour découvrir nouvelle biologie et amélioration des états pathologiques. Pour plus d’un demi siècle¹, l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, a été un modèle pour les études sur un large éventail de sujets en biologie fondamentale et de la biomédecine, y compris le contrôle génétique du développement. Historiquement, la plupart des recherches sur Xenopus a utilisé la grenouille allotétraploïde, X. laevis, mais plus récemment, en raison de la diploïdie, X. tropicalis a été conçu comme un modèle génétique amphibie. Séquences de génomes complets ont été assemblés entre les deux espèces de Xenopus ^2,3. La « communauté de la grenouille » est maintenant à un moment charnière où la technologie de modification du génome de base permet l’étude de la fonction des gènes, pratiquement à volonté. Programmable CRISPR/Cas9 endonucléases ont fait la mutagénèse de gènes très efficace, avec mutations bialléliques possible dans la plupart des cellules de l’animal^{4,5,6,7, 8,9,10,11}. Ces études, mise en évidence par Blais et al. ¹² et Shigeta et al. ¹³, ont montré que la fonction de plusieurs gènes peut être étudiée par mutagenèse chez les animaux de mosaïque de₀ F. Cette approche présente de nombreux avantages ; Cependant, embryons Cas9-sgRNA-micro affichent souvent des phénotypes variables en raison de la perte incomplète de la fonction (LOF). Plus important encore, la génération des lignées mutantes est très avantageuse pour certaines applications, en particulier lorsque l’on étudie les gènes qui ont une contribution d’ARNm maternels. ARNm maternels et protéines et leurs influences sur l’épigénétique, persistent pendant une longue période dans l’embryogenèse^14,15,16, rendant les contributions du développement précoces de plusieurs gènes réfractaire aux analyses de₀ F. Par conséquent, les autres approches LOF sont nécessaires.

Lorsqu’on cherche à créer des lignées mutantes, le chemin d’accès à l’obtention d’embryons homozygotes de LOF a plusieurs obstacles. Mutagenèse tout d’abord, efficace pour produire des mutations bialléliques peut être désavantageux car perte des fonctions des gènes essentiels se traduit par l’incapacité à survivre à la maturité sexuelle, interférant avec la production d’une ligne viable. Une solution commune est le titrage minutieux d’un montant de Cas9-sgRNA envoyée. Ici, l’objectif est d’atteindre un équilibre entre réduction de létalité tout en optimisant également l’efficacité de la lignée germinale mutagenèse. Un autre problème se pose du schéma standard d’élevage, où les analyses phénotypiques sont différés jusqu’à la génération de₂ F. À l’aide de l’approche standard, sexuellement matures animaux de₀ F qui transmettent mutant allèles par le biais de la lignée germinale sont croisées pour produire des F₁ hétérozygote « entreprises », qui sont ensuite cultivées à la maturité sexuelle. Deux hétérozygotes de₁ F sont ensuite intercroisées pour produire des embryons mutants, F₂ à une fréquence mendélienne prévue de 25 %. Ainsi, deux générations d’élevage sont nécessaires pour l’analyse des phénotypes mutants. Animaux mutants pourrait être homozygotes ou hétérozygotes (c.-à-d. descendants contenant deux allèles mutants différents, qui dépend des génotypes des parents animaux utilisés dans la population de₁ F).

Ces obstacles peuvent être surmontés en limitant programmable mutagenèse induite par la nucléase de cellules germinales, qui sous-tend une nouvelle méthode appelée former¹⁷. Saute-mouton possède deux composantes principales : (1) la microinjection des ARNm de Cas ainsi que sgRNA ou nucléase-sgRNA complexes (ou, en principe, TALENs ou zinc nucléases de doigt) au stade unicellulaire de mutagenize efficacement les génomes embryonnaires, suivie (2) la transplantation de PGC dans des embryons de frère de type sauvage, où le PGC endogènes ont été supprimés. Quand les deux étapes sont le remplacement de germline efficace, complète avec les cellules germinales mutantes peut être obtenue. Blackler démontré dans les années 1960 que Xenopus PGC pourrait être transplanté entre embryons à la neurula fin et^18,de stades précoces tailbud¹⁹. Pour brûler les étapes, l’approche de Blackler modification en effectuant les transplantations d’organes au stade blastula¹⁷, lorsque PGC est localisées dans le pôle végétal de l’embryon^20,21. Transplantation avant la gastrulation a deux principaux avantages. Tout d’abord, la prise de greffe des greffes et le développement subséquent de normal s’est avéré plus efficace lorsque la greffe est réalisée au stade blastula (inédites). Deuxièmement, en effectuant des transplantations d’organes stade blastula peu après que transcription zygotique a commencé, on peut éviter la létalité découlant du développement génétique mutations qui perturbent la gastrulation, ou qui autrement mener à neurula fin malformé. PGC transplantation portant les embryons (« leapfrogged ») sont cultivés à la maturité sexuelle, et les croisements entre ces animaux de₀ F ont démontré que, dans bien des cas, 100 % de la progéniture de₁ F afficher le phénotype LOF (la plupart étant composé hétérozygotes), indiquant la lignée germinale complète de remplacement avec les mutations ciblées.

Il est prévu que Bond s’accélérera les approches génétiques chez Xenopus. Brûler les étapes prévoit également une alternative à la méthode de « transfert d’accueil »²² pour l’analyse LOF des gènes effet maternel (inédites). Dans la présente publication, une description détaillée de la méthode, en focalisant sur la transplantation de PGC, est présentée dans X. tropicalis (avec des modifications mineures pour X. laevis). La transplantation du PGC est démontrée ici, pour faciliter un transfert plus rapid de cette technologie à d’autres laboratoires qui travaillent avec Xenopus. Les principes de cette méthode doivent être réussies chez les autres amphibiens (p. ex., urodèles), et modifications de l’organisme-spécifiques dans la méthodologie devraient permettre pour application à de nombreux autres animaux dont mutagénèse efficace peut être accompli et PGC est facilement transplantables.