زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

وقد كيف بالنمط الوراثي ترميز النمط الظاهري مسألة رئيسية في علم الأحياء منذ إعادة اكتشاف قوانين مندل. فهم أدوار الجينات وتنظيمها والتفاعلات داخل شبكات الجينات، ووظائف المنتجات المشفرة بالوعود تقديم أدوات للكشف عن الأحياء الجديدة وتحسين المرض الدول. لأكثر من نصف قرن¹، كان الضفدع الأفريقية المخالب، النمو، نموذجا رائدا للدراسات بشأن طائفة واسعة من المواضيع في البيولوجيا الأساسية والطب الحيوي، بما في ذلك عنصر التحكم الوراثي للتنمية. تاريخيا، استخدمت معظم البحوث بشأن النمو الضفدع اللوتيترابلويد، X. laevis، ولكن في الآونة الأخيرة، وضعت بسبب ما ديبلويدي، X. tropicalis كنموذج وراثية البرمائية. وقد تم تجميع تسلسل الجينوم الكامل من كل الأنواع النمو ^2،3. “المجتمع الضفدع” الآن في نقطة تحول حيث تسمح تقنية تعديل الجينوم الأساسي دراسة وظيفة الجينات، وتقريبا في الإرادة. برمجة كريسبر/Cas9 اندونوكليسيس جعلت الطفرات الجينات ذات كفاءة عالية، مع الطفرة بياليليك ممكن في معظم الخلايا الحيوانية^4،5،،من^{67، 8،9،،}من¹⁰¹¹. هذه الدراسات، وأبرز بهاتاشاريا et al. ¹² وشيجيتا et al. ¹³، قد أظهرت أن الدالة العديد من الجينات يمكن أن يدرسها الطفرات في و₀ فسيفساء الحيوانات. وهذا النهج له العديد من المزايا؛ ومع ذلك، عرض الأجنة Cas9-سجرنا-ميكروينجيكتيد غالباً ما تعمل متغير بسبب فقدان وظيفة (LOF) غير مكتملة. الأهم من ذلك، توليد خطوط متحولة مفيد جداً لبعض التطبيقات – وبخاصة عند دراسة الجينات التي لها مساهمة مرناً النفاسية. مرناس الأمهات والبروتينات، وتأثيراتها على التخلق، تستمر لفترة طويلة في امبريوجينيسيس^14،،من¹⁵¹⁶، تقديم المساهمات الإنمائية المبكرة العديد من الجينات صهر للتحليلات و₀ . ولذلك، نهج LOF أخرى مطلوبة.

عندما تسعى إلى إنشاء خطوط متحولة، والمسار للحصول على الأجنة LOF متماثل قد عدة عقبات. يمكن أن تكون الطفرات أولاً، تتسم بالكفاءة لإنتاج طفرات بياليليك غير ملائم نظراً لفقدان وظائف الجينات الأساسية يؤدي إلى الفشل في البقاء على قيد الحياة إلى مرحلة النضج الجنسي، تتداخل مع إنتاج خط قابلة للحياة. حل مشترك هو المعايرة الدقيق مقدار Cas9-سجرنا تسليمها. هنا، أن الهدف تحقيق توازن بين خفض الفتك مع تعظيم كفاءة الطفرات germline أيضا. ظهرت مشكلة ثانية من نظام تربية قياسية، حيث يتم تأجيل تحليلات المظهرية إلى الجيل₂ و. استخدام النهج الموحدة، ناضجة جنسياً و₀ الحيوانات التي تنقل المسخ الآليلات من خلال الخط يتم أووتكروسيد لإنتاج و₁ متخالف “ناقلات”، التي تزرع ثم إلى مرحلة النضج الجنسي. ثم يتم إينتيركروسيد اثنين heterozygotes₁ و إنتاج و₂ أجنة المسخ في تردد مندلية المتوقعة بنسبة 25%. وهكذا، جيلين تربية ضرورية لتحليل تعمل المسخ. يمكن أن تكون الحيوانات المسخ homozygotes أو heterozygotes المركب (أي ذرية تحتوي على اثنين من الآليلات المختلفة المسخ، الذي يعتمد على الأنماط الجينية للحيوانات الأبوية المستخدمة في إينتيركروس₁ و).

ويمكن التغلب على هذه العقبات بقصره للبرمجة نوكلاس بوساطة الطفرات في الخلايا الجرثومية، الذي يكمن وراء طريقة جديدة تسمى الوثب¹⁷. قفزات واسعة بعنصرين رئيسيين هما: (1) microinjection مرناً Cas جنبا إلى جنب مع سجرنا، أو مجمعات سجرنا nuclease (أو في مبدأ أو تالينس أو الزنك nucleases الإصبع) مرحلة وحيدة الخلية كفاءة موتاجينيزي الجينوم الجنينية، تليها (2) زرع بجكس إلى أجنة الأخوة wildtype، حيث أزيلت بجكس الذاتية. يمكن الحصول على كل الخطوات عند استبدال الخط كاملة، وكفاءة مع الخلايا الجرثومية المسخ. أظهر بلاكلير في أوائل الستينات أن يمكن زرع بجكس النمو بين الأجنة في نارولا الراحل وأوائل تايلبود مراحل^18،19. للقفزات، تعديل النهج الذي بلاكلير بالقيام عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا¹⁷، عندما يتم ترجمة بجكس في القطب فيجيتال^20،الجنين²¹. وقد زرع قبل gastrulation اثنين من المزايا الرئيسية. أولاً، تم العثور على انجرافتمينت لعمليات زرع الأعضاء والتطور الطبيعي اللاحقة لتكون أكثر فعالية عندما يتم زرع الأعضاء في مرحلة البلاستولا (الملاحظات غير منشورة). ثانيا، عن طريق إجراء عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا بعد وقت قصير من النسخ زيجوتيك وقد بدأ، واحد تجنب الفتك الناشئة عن الجينات الإنمائية الطفرات التي تعطل gastrulation أو خلاف ذلك يؤدي إلى تالف نارولا أواخر. وتزرع PGC الحاملة لزرع الأجنة (“تخطي”) إلى مرحلة النضج الجنسي، وإينتيركروسيس بين هذه الحيوانات₀ و قد أثبتت أنه في كثير من الحالات، عرض 100 ٪ ذرية₁ و النمط الظاهري LOF (معظم يجري مجمع heterozygotes)، التي تشير إلى استبدال الخط كاملة مع التحولات المستهدفة.

ومن المتوقع أن القفزات سوف تعجل بالنهج الوراثية في النمو. قفزات واسعة كما يوفر بديلاً ل أسلوب “مضيفة نقل”²² لتحليل LOF للأمهات تأثير الجينات (الملاحظات غير منشورة). في المنشور الحالي، يرد وصف مفصل للطريقة، وتركز بصفة خاصة على زرع PGC، في X. tropicalis (مع تعديلات طفيفة ل X. laevis). ويتجلى زرع بجكس هنا لتسهيل نقل هذه التكنولوجيا أكثر سرعة إلى مختبرات أخرى تعمل مع النمو. ينبغي أن تكون مبادئ هذا الأسلوب الناجح في البرمائيات الأخرى (مثلاً، أوروديليس)، والتعديلات الخاصة بالكائن الحي في المنهجية التي ينبغي أن تسمح بالتطبيق للعديد من الحيوانات الأخرى التي يمكن تحقيق كفاءة الطفرات و بجكس سهولة الأولى.