Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína
Summary
A eletroforese em gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental para analisar as interações RNA-proteína. Tradicionalmente, a maioria das experiências usou géis verticais. No entanto, os géis horizontais oferecem várias vantagens, como a oportunidade de monitorar complexos durante a eletroforese. Nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal.
Abstract
A eletroforese de gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental da biologia molecular que tem sido amplamente utilizada para a análise bioquímica das interações RNA-proteína. Essas interações foram tradicionalmente analisadas com géis de poliacrilamida gerados entre duas placas de vidro e amostras submetidas a eletroforese verticalmente. No entanto, os géis de poliacrilamida moldados em bandejas e submetidos a electroforese horizontalmente oferecem várias vantagens. Por exemplo, géis horizontais utilizados para analisar complexos entre substratos de ARN fluorescentes e proteínas específicas podem ser imaginados várias vezes à medida que a eletroforese progride. Isso proporciona a oportunidade única de monitorar complexos de RNA-proteína em vários pontos durante o experimento. Além disso, a eletroforese horizontal em gel possibilita analisar muitas amostras em paralelo. Isso pode facilitar muito as experiências de tempo, bem como analisar várias reações simultaneamente para comparar diferentes componentes e condições. Aqui nós prUm protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal para analisar as interações RNA-Proteína.
Introduction
Os ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSAs) provaram ser uma ferramenta bioquímica inestimável para analisar as interações específicas de proteína-nucleico 1 , 2 , 3 . Esses ensaios podem fornecer informações importantes sobre a afinidade de ligação das proteínas ao RNA ou DNA 3 , a estequiometria componente dos complexos de ácido nucleico-proteína 1 e fornecem novos pontos de vista importantes sobre a especificidade de ligação das proteínas de ligação de ARN através de experiências de competição de substrato 1 .
A configuração experimental tradicional para estes ensaios consiste em misturar a proteína purificada com um substrato de ARN radiomarcado. Os complexos resultantes são então analisados com géis de poliacrilamida não desnaturantes (nativos) vertidos entre duas placas de vidro seguidas por eletroforese de amostra num aparelho vertical 3. Embora esta abordagem tenha sido utilizada de forma exaustiva para fornecer informações importantes sobre os mecanismos bioquímicos subjacentes à ligação das proteínas aos ácidos nucleicos, ela também possui várias limitações. Por exemplo, esta estratégia básica tem um rendimento relativamente baixo e não é facilmente adaptável para aplicações que exigem a análise de muitas reações vinculativas em paralelo. Além disso, com o aparelho vertical tradicional, é desafiador monitorizar complexos em várias ocasiões durante a eletroforese 3 , 4 .
Aqui apresentamos uma adaptação do ensaio EMSA que utiliza géis nativos de poliacrilamida em um aparelho de platina, eletroforese horizontal e substratos de ARN marcados fluorescentemente 4 , 5 , 6 , 7 . A incorporação dessas modificações relativamente simples ao nível básicoTegy oferece algumas vantagens poderosas. Em particular, o formato de plataforma horizontal facilmente se presta a analisar dúzias de amostras simultaneamente 4 . Além disso, para alguns complexos de RNA-proteína, tais como aqueles formados entre a proteína Bicaudal-C e sua eletroforese de substrato de ARN em um gel horizontal, proporciona uma capacidade aumentada para resolver complexos distintos de proteína RNA e discriminar estes de substrato de ARN não ligado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os géis nativos de poliacrilamida são uma ferramenta inestimável para investigar as interações proteína-ARN e, tradicionalmente, esses géis são submetidos a eletroforese verticalmente 2 , 3 . Utilizamos uma modificação do protocolo que substitui géis de poliacrilamida nativos criados e submetidos a eletroforese horizontalmente 1 , 4 , 6 , <sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Laura Vanderploeg pela preparação de números. O trabalho no laboratório Sheets é suportado pela subvenção NSF 1050395 e pela concessão NIH (R21HD076828). O trabalho no laboratório Ryder é suportado por concessões do NIH R01GM117237 e R01GM117008. Megan Dowdle é apoiada por uma Bolsa de Oportunidades Avançadas da SciMed GRS através da Escola de Pós-Graduação da Universidade de Wisconsin-Madison e do Programa de Treinamento em Biotecnologia através do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (T32GM008349).
Materials
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
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