Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen
Summary
Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Instrument zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen. Traditionell haben die meisten Experimente vertikale Gele verwendet. Jedoch bieten horizontale Gele mehrere Vorteile, wie die Möglichkeit, Komplexe während der Elektrophorese zu überwachen. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Verfügung.
Abstract
Die native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Werkzeug der Molekularbiologie, das ausgiebig für die biochemische Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde. Diese Wechselwirkungen wurden traditionell mit Polyacrylamidgelen analysiert, die zwischen zwei Glasplatten und Proben hergestellt wurden, die vertikal elektrophoretisch wurden. Allerdings bieten Polyacrylamidgele, die in Tabletts gegossen und horizontal elektrophoresiert werden, mehrere Vorteile. Zum Beispiel können horizontale Gele, die verwendet werden, um Komplexe zwischen fluoreszierenden RNA-Substraten und spezifischen Proteinen zu analysieren, mehrfach abgebildet werden, wenn die Elektrophorese fortschreitet. Dies bietet die einzigartige Möglichkeit, RNA-Protein-Komplexe an mehreren Punkten während des Experiments zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht die horizontale Gelelektrophorese, mehrere Proben parallel zu analysieren. Dies erleichtert die zeitlichen Verlaufsexperimente und analysiert gleichzeitig mehrere Reaktionen, um verschiedene Komponenten und Bedingungen miteinander zu vergleichen. Hier sind wir prOvide ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen.
Introduction
Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSAs) haben sich als ein unschätzbares biochemisches Instrument erwiesen, um spezifische Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen 1 , 2 , 3 zu analysieren. Diese Assays können wichtige Informationen in Bezug auf die Bindungsaffinität von Proteinen an RNA oder DNA 3, die Komponente Stöchiometrie von Nukleinsäure-Protein – Komplexe 1 und liefern wichtige neue Erkenntnisse über die Bindungsspezifität der RNA – Bindeproteine via Substrat Kompetitionsexperimente 1.
Der traditionelle experimentelle Aufbau für diese Assays besteht darin, gereinigtes Protein mit einem radioaktiv markierten RNA-Substrat zu mischen. Die resultierenden Komplexe werden dann mit nicht denaturierenden (nativen) Polyacrylamidgelen analysiert, die zwischen zwei Glasplatten gefolgt von einer Probenelektrophorese in einer vertikalen Vorrichtung 3 gegossen werden. Während dieser Ansatz erschöpfend genutzt wurde, um wichtige Einblicke in die biochemischen Mechanismen zu liefern, die der Bindung von Proteinen an Nukleinsäuren zugrunde liegen, hat sie auch mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel hat diese Grundstrategie einen relativ geringen Durchsatz und ist für Anwendungen, die viele analoge Bindungsreaktionen parallel analysieren, nicht leicht anpassbar. Darüber hinaus ist es bei der traditionellen vertikalen Apparatur schwierig, die Komplexe während der Elektrophorese 3 , 4 mehrfach zu überwachen.
Hier stellen wir eine Adaption des EMSA-Assays vor, der native Polyacrylamidgele verwendet, die in eine Flachbettapparatur, horizontale Elektrophorese und fluoreszenzmarkierte RNA-Substrate 4 , 5 , 6 , 7 gegossen werden. Die Einarbeitung dieser relativ einfachen Modifikationen an die Basis-StrTegy bietet einige mächtige Vorteile. Insbesondere das horizontale Flachbettformat eignet sich leicht zur gleichzeitigen Analyse von Dutzenden von Proben 4 . Auch für einige RNA-Proteinkomplexe, wie jene, die zwischen dem Bicaudal-C-Protein und seiner RNA-Substrat-Elektrophorese in einem horizontalen Gel gebildet werden, ergibt sich eine erhöhte Fähigkeit, unterschiedliche RNA-Protein-Komplexe aufzulösen und diese aus dem ungebundenen RNA-Substrat zu unterscheiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Native Polyacrylamidgele sind ein unschätzbares Hilfsmittel zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen und traditionell werden diese Gele vertikal 2 , 3 elektrophoresiert. Wir haben eine Modifikation des Protokolls verwendet, das native Polyacrylamidgele ersetzt, die horizontal hergestellt und elektrophoresiert werden 1 , 4 , 6 , 7</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Laura Vanderploeg für die Vorbereitung von Figuren. Die Arbeit im Sheets Labor wird von NSF Grant 1050395 und NIH Grant (R21HD076828) unterstützt. Die Arbeit im Ryder Labor wird von NIH Stipendien R01GM117237 und R01GM117008 unterstützt. Megan Dowdle wird von einem SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship durch University of Wisconsin-Madison Graduate School und Biotechnology Trainingsprogramm durch das National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (T32GM008349) unterstützt.
Materials
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
