الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا
Summary
الأصلي بول أكريلاميد هلام الكهربائي هو أداة أساسية لتحليل التفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. تقليديا استخدمت معظم التجارب المواد الهلامية العمودية. ومع ذلك، توفر المواد الهلامية الأفقية العديد من المزايا، مثل فرصة لمراقبة المجمعات أثناء الكهربائي. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتوليد واستخدام الأفقي هلام الأصلي الكهربائي.
Abstract
بول أكريلاميد الأصلي الكهربائي هلام هو أداة أساسية من البيولوجيا الجزيئية التي استخدمت على نطاق واسع للتحليل البيوكيميائية للتفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. وقد تم تحليل هذه التفاعلات تقليديا مع المواد الهلامية بولي أكريلاميد ولدت بين اثنين من لوحات الزجاج والعينات إليكتروفوريسد عموديا. ومع ذلك، المواد الهلامية بولكرلميد يلقي في الصواني و إليكتروفوريسد أفقيا يقدم العديد من المزايا. على سبيل المثال، المواد الهلامية الأفقية المستخدمة لتحليل المجمعات بين ركائز الفلورسنت رنا والبروتينات محددة يمكن تصوير عدة مرات كما تقدم الكهربائي. وهذا يوفر فرصة فريدة لرصد المجمعات رنا البروتين في عدة نقاط خلال التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، الأفقي هلام الكهربائي يجعل من الممكن لتحليل العديد من العينات بالتوازي. وهذا يمكن أن يسهل كثيرا من التجارب بالطبع الوقت وكذلك تحليل ردود الفعل متعددة في وقت واحد لمقارنة المكونات والظروف المختلفة. هنا نحن بيأرأوفيد بروتوكول مفصلة لتوليد واستخدام الأفقي الكهربائي هلام الأصلي لتحليل التفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين.
Introduction
وقد أثبتت مقايسات التحول التنقل الكهربي (إمساس) أن تكون أداة بيوكيميائية لا تقدر بثمن لتحليل تفاعلات حمض البروتين النووي محددة 1 ، 2 ، 3 . هذه المقايسات يمكن أن توفر معلومات هامة بشأن تقارب ملزمة من البروتينات إلى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي 3 ، مكون الكيمياء المتفاعلة من المجمعات الحمض النووي البروتين 1 وتوفير رؤى جديدة هامة حول خصوصية ملزمة للبروتينات ملزمة رنا عبر التجارب المنافسة الركيزة 1 .
الإعداد التجريبي التقليدي لهذه المقايسات يتكون من خلط البروتين النقي مع راديولبلد رنا ركيزة. ثم يتم تحليل المجمعات الناتجة مع المواد الهلامية بوليكرلميد غير تغيير طبيعة (الأم) سكب بين اثنين من لوحات الزجاج تليها عينة الكهربائي في جهاز عمودي 3. في حين تم استخدام هذا النهج على نحو شامل لتوفير رؤى هامة في الآليات الكيميائية الحيوية التي تكمن وراء ارتباط البروتينات إلى الأحماض النووية، كما أن لديها العديد من القيود. على سبيل المثال، هذه الاستراتيجية الأساسية لديها منخفضة نسبيا الإنتاجية وأنها ليست قابلة للتكيف بسهولة للتطبيقات التي تتطلب تحليل العديد من ردود الفعل ملزمة في موازاة ذلك. وبالإضافة إلى ذلك، مع الجهاز الرأسي التقليدي فإنه من الصعب أن يحتمل رصد المجمعات في عدة مرات خلال الكهربائي 3 ، 4 .
هنا نقدم التكيف من الفحص إمزا الذي يستخدم المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأم يلقي في جهاز مسطحة، الكهربائي الأفقي و فلورزنتلي المسمى ركائز رنا 4 ، 5 ، 6 ، 7 . دمج هذه التعديلات بسيطة نسبيا على سترا الأساسيةتيغي يوفر بعض المزايا القوية. على وجه الخصوص، فإن الشكل المسطح الأفقي بسهولة يفسح المجال لتحليل عشرات العينات في وقت واحد 4 . أيضا، بالنسبة لبعض المجمعات البروتين الحمض النووي الريبي، مثل تلك التي شكلت بين البروتين بيكودال-C والرنا الركيزة الكهربائي في هلام أفقي يوفر زيادة القدرة على حل المجمعات رنا البروتين متميزة وتمييز هذه من الركيزة رنا غير منضم.
Protocol
Representative Results
Discussion
المواد الهلامية بولكرلميد الأصلية هي أداة لا تقدر بثمن للتحقيق التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي وتقليديا هذه المواد الهلامية هي إليكتروفوريسد عموديا 2 ، 3 . لقد استخدمنا تعديل البروتوكول الذي يحل المواد الهلامية بولكرلميد الأم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر لورا فاندربلوغ لإعداد الأرقام. ويدعم العمل في المختبر صفائح من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة 1050395 ومنح المعاهد الوطنية للصحة (R21HD076828). ويدعم العمل في مختبر رايدر من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM117237 و R01GM117008. ويدعم ميغان دودل من قبل زميد غرس فرصة متقدمة زمالة من خلال جامعة ويسكونسن ماديسون كلية الدراسات العليا وبرنامج التدريب على التكنولوجيا الحيوية من خلال المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (T32GM008349).
Materials
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
