Kromatin İmmunopresipitasyon için Çapraz Bağlı İskelet Kasında Yüksek Kaliteli Nükleerlerin Hazırlanması İçin Filtrasyona Dayalı Bir Yöntem
Summary
Çapraz bağlantılı fare iskelet kasında yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için filtrasyon tabanlı bir protokol sunuyoruz ki, ultra-santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırdık ve kolay uygulanabilir hale getirdik. Çekirdeklerden hazırlanan kromatin, kromatin immünopresipitasyonu ve muhtemelen kromatin immünopresipitasyon sıralama çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir.
Abstract
Kromatin immüno çökeltme (ChIP), kromatin DNA'ya bağlanan proteini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Bununla birlikte, fibreden zengin iskelet kası, yüksek kaliteli çekirdeklerin miyofibrillerin en az kirletilmesiyle izole edilmesindeki teknik zorluk nedeniyle ChIP için bir zorluk olmuştur. Önceki protokoller, çekirdeği çapraz bağlamadan önce arıtmaya çalışmış ve bu da uzun çekirdek hazırlama işlemi sırasında değişmiş DNA-protein etkileşimi riskini doğurmuştur. Mevcut protokolde, önce farelerden toplanan iskelet kas dokusunu çapraz bağladık ve dokular kıyılmış ve sonike edildi. Çoğaltılmış kas dokusu kullanarak çekirdekleri miyofibrillerden ayıramadığını buldukumuzdan, önemli miyofibril kontaminasyonu olmayan yüksek kaliteli çekirdekler elde etmek için ardışık bir filtrasyon prosedürü geliştirdik. Daha sonra bir ultrasonatör kullanarak kromatin hazırladık ve anti-BMAL1 antikoru ile yapılan ChIP analizleri, sirkadiyen bağlanmayı sağlamıştırBMAL1 modelinin gen promoterlerini hedeflemesi. Bu filtreleme protokolü, yüksek kaliteli çekirdekleri çapraz bağlı iskelet kası dokusundan izole etmek için kolayca uygulanabilir bir yöntem oluşturur ve sirkadiyen ve zamana duyarlı diğer çalışmalar için tutarlı örnek işlenmesine izin verir. Yeni nesil sıralama (NGS) ile birlikte, yöntemimiz iskelet kası fonksiyonuna odaklanan çeşitli mekanik ve genomik çalışmalar için kullanılabilir.
Introduction
İskelet kası fizyolojide ve davranışta önemli rol oynamaktadır. Çok çekirdekli kas lifi, aktin ve miyozinin kasılma kuvveti oluşturmak için sarkomerler denilen işlevsel birimleri oluşturduğu miyofibrillerden oluşur. İskelet kası aynı zamanda vücudun en büyük metabolizma organıdır, postprandial glikoz alımının>% 80'ini ve insülin tepkisini ve metabolik homeostazı düzenleyen 1 , 2'yi hesaplar. Kas fizyolojisi ve metabolizması sirkadiyen saat, 3 , 4 , 5 , 6 nispi biyolojik zamanlayıcı tarafından yakından düzenlenir. Örneğin, çekirdeğin sirkadiyen saat bileşenlerinden biri olan Bmal1'in iskelet kasına özgü silinmesi, iskelet kasında insülin direnci ve glukoz alımını azalttı ve hayvanlarda tip 2 diyabet 7 geliştiği bulundu. benAyrıca, iskelet kası, sistemik metabolizma ve fizyolojiyi düzenlemek için mokinleri salgılayan bir endokrin organ 8 olarak giderek daha fazla takdir edilmektedir. İskelet kasında bu düzenleyici işlevleri tam olarak anlamak için mekanik çalışmalara ihtiyaç vardır.
ChIP, DNA bağlayıcı proteinlerin hızlandırıcı alımını tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. ChIP başlangıçta kromatin DNA 9 , 10'daki nükleozom organizasyonunu tanımlamak için geliştirildi. O zamandan beri çeşitli yöntemlerin, formaldehit, dimetil sülfat veya mor ötesi ışınlama (UV) 11 , 12 kullanarak proteinleri ve kromatin DNA'yı çapraz bağladığı bildirildi. Formaldehit çapraz bağlanma, kromatin yapısını koruyan ve DNA-protein etkileşimlerini koruyan en yaygın yöntemdir ( 9 , 13 , 14) . Çapraz bağlı kromatografiSonication tarafından parçalanmış ve ilgilenilen belirli DNA bağlama proteinine karşı antikor ile immüno-çökeltilmiş 15 , 16 . Son yıllarda, genom çapında transkripsiyon faktörü bağlama 17'yi sorgulamak için ChIP'i NGS ile birleştiren bir yöntem olan ChIP sıralama (ChIP-sequ) geliştirildi ve bazı durumlarda bir süre içerisinde dinamik değişiklikleri izlemek için 18 , 19 , 20 . Örneğin, sirkadiyen ChIP-seq çalışmaları, sirkadiyen saat bileşenlerinin ve histone belirteçlerinin genomik olarak bağlanmasını düzenleyen, ~ 24 saatlik döngüsel döngü 18 boyunca geçici gen ifadesini sürükleyen, oldukça düzenlenmiş bir dizi ortaya koymuştur.
Çoğu mevcut ChIP protokolleri yumuşak dokular ( örneğin karaciğer, beyin vb. ) Için tasarlanmıştır ve skele dahil olmak üzere sert dokular için çok az yayınlanmıştırKas kas. Fiberle zengin iskelet kasını homojenize etmek ve özellikle çapraz bağlanmayı gerektiren ChIP deneyleri için yüksek kaliteli çekirdekleri 21 izole etmek teknik açıdan zorlayıcı bir işlemdir. Yeni bir kas ChIP çalışmasında22, uydu hücreleri miyofiberlerden ayrılmış ve çekirdekler, doku sindirimini içeren uzun bir prosedür aracılığıyla her iki hücre tipinden hazırlanmıştır. İzole edilmiş çekirdekler üzerinde formaldehit çapraz bağlanmadan önce tüm işlemin tamamlanması yaklaşık üç saat sürdü. Bu prosedür kas dokusunu etkin homojenizasyon için daha da dirençli hale getiren ve yüksek kaliteli çekirdekler üretebilen kas lifini çapraz bağlamayı önlerken doku toplanmasından çekirdek çapraz bağlanmaya kadar olan önemli zaman gecikmesi, değişmiş DNA riskini doğurur -protein etkileşimi. Buna karşın, çoğu çalışma deneysel muamele ya da doku toplanması sonrasında gerçek zamanda DNA-proteinin korunması için çapraz bağlama gerçekleştirmiştirN bağlayıcı 12 . Çapraz bağlantıdan önce çekirdek izolasyonunun ikinci bir dezavantajı, tipik olarak 3-4 saat aralıklarla ortaya çıkan sirkadiyal örnek toplama gibi zamana duyarlı uygulamaların engellenmesidir. Çekirdeklerin çapraz bağlanması olmaksızın, izolasyonun kesilme işleminden hemen sonra ilerlemesi gerekirken çapraz bağlı numuneler, tüm zaman çizelgesi tamamlandıktan sonra birlikte işlenebilir ve böylece daha fazla deney tutarlılığı sağlanır.
Çapraz bağlanmamış iskelet kasında çekirdek izolasyonu için diğer protokoller de bildirilmiştir. İki çalışma, çekirdekleri kalan miyofibriller ve hücre öpleri 23,24'ten ayırmak için gradyan ultra-santrifüj kullandığını açıkladı. Sükroz veya koloidal gradyent ultra-santrifüj, çapraz bağlanmamış kas dokuları ile etkili olsa da, deneylerimiz, çapraz bağlamadan sonra gradyan ultra-santrifüj işlemi ile çekirdeklerin hücre d'den ayrımında başarısız olduğunu ortaya koymuşturDegrade üzerinde ebris.
Bu nedenle, çapraz bağlı fare iskelet kas dokuları kullanarak yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir prosedür geliştirdik. Degrade ultra-santrifüjden ziyade, çekirdeği enkaztan etkili bir şekilde ayırmak için seri bir filtreleme yöntemi geliştirdik. Ultrasonication işlemini takiben, kromatin örnekleri, hedef geliştiricilere bağlanan BMAL1 proteininin sirkadiyen bir modeli gösteren ChIP çalışmaları için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Metodumuz, kas dokularının çeşitli mekanik çalışmalarına genel olarak uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için çapraz bağlı iskelet kas dokularının kullanıldığı sağlam bir yöntemi açıkladık. Çekirdekleri enkazdan etkili bir şekilde ayırmak için sıralı filtreleme yapıldı ve çanak şeklinde dönüştürücüden gelen ultrasonik akustik enerji, ChIP analizi için kromatı kesti. Sonuçlar BMAL1'in hedef promoterlere sirkadiyen zamana özel bağlanmasını gösterdi.
ChIP, çapraz bağlanma gerçekleştiğinde genomik DNA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Karyn Esser, Nobuya Koike ve Noheon Park'a faydalı tavsiyeler için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen S.-HY'ye NIH / NIGMS (R01GM114424) ve Robert A. Welch Vakfı (AU-1731) ve NIH / NIA (R01AG045828) tarafından ZC'ye destek verildi
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
