Метод на основе фильтрации на основе высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы для иммунопреципитации хроматина

Скелетные мышцы играют важную роль в физиологии и поведении. Многонуклеированное мышечное волокно состоит из миофибрилл, где функциональные единицы актина и миозина образуют саркомеры для создания сократительной силы. Скелетные мышцы также являются крупнейшим метаболическим органом в организме, что составляет> 80% потребления постпрандиальной глюкозы на 80% и регулирует реакцию инсулина и метаболический гомеостаз ^{1 , 2} . Физиология мышц и метаболизм тесно регулируются циркадианными часами, внутренним биологическим таймером ^{3 , 4 , 5 , 6} . Например, скелетная мускулативная делеция Bmal1 , одного из основных циркадных компонентов часов, привела к резистентности к инсулину и уменьшению поглощения глюкозы в скелетных мышцах, и у животных, как было установлено, развился диабет 2 типа. яКроме того, скелетные мышцы также все чаще оцениваются как эндокринный орган ⁸ , выделяя миокины для регулирования системного метаболизма и физиологии. Механические исследования необходимы для полного понимания этих регуляторных функций в скелетных мышцах.

ChIP является мощным подходом к разграничению рекомбинации промоторов ДНК-связывающих белков. Первоначально ChIP был разработан для идентификации нуклеосомной организации на ДНК хроматина ^{9 , 10} . С тех пор сообщалось о различных методах сшивания белков и хроматиновой ДНК с использованием формальдегида, диметилсульфата или ультрафиолетового облучения (УФ) ^{11 , 12} . Формальдегидная сшивка является наиболее часто используемой, сохраняющей структуру хроматина и ДНК-белковыми взаимодействиями ^{9 , 13 , 14} . Сшитая хроматографияIn, измельчается ультразвуком и иммунопреципитируется антителом против специфического связывающего ДНК белка, представляющего интерес ^{15 , 16} . В последние годы было разработано ChIP-секвенирование (ChIP-seq), метод, объединяющий ChIP с NGS, для опроса связывания фактора транскрипции генома ¹⁷ , а в некоторых случаях для мониторинга динамических изменений за время ^{18 , 19 , 20} , Например, циркадные исследования ChIP-seq выявили высокоорганизованную последовательность геномного связывания циркадных часовых компонентов и гистоновых маркеров, которые приводят к временной точной экспрессии генов в течение 24-часового циркадного цикла ¹⁸ .

Большинство доступных протоколов ChIP предназначены для мягких тканей ( например, печени, головного мозга и т. Д. ), И очень немногие были опубликованы для твердых тканей, включая скелеМышцы. Технически сложно гомогенизировать богатую клетчаткой скелетную мышцу и изолировать высококачественные ядра ²¹ , особенно для экспериментов ChIP, которые требуют сшивания. В недавнем исследовании ChIP ²² мышц сателлитные клетки были отделены от миофибрилл, и ядра были получены из обоих типов клеток с помощью продолжительной процедуры, включающей переваривание тканей. Весь процесс занимает примерно три часа, чтобы завершить сшивку формальдегида на изолированных ядрах. В то время как в этой процедуре избегалось сшивание мышечного волокна, что делает мышечную ткань еще более огнестойкой для эффективной гомогенизации и способно производить высококачественные ядра, значительная временная задержка от сбора тканей до сшивания ядер приводит к риску изменения ДНК -протеинового взаимодействия. В отличие от этого, большинство исследований выполняли сшивание сразу после экспериментального лечения или сбора ткани, чтобы сохранить ДНК-протеины в реальном времениN привязка ¹² . Второй недостаток изоляции ядер перед сшиванием состоит в том, что он исключает приложения, чувствительные к времени, такие как циркадный сбор проб, который обычно происходит с интервалами 3-4 ч. Без поперечной сшивки ядер изоляция должна протекать сразу же после вскрытия, тогда как сшитые образцы могут быть обработаны вместе по завершении всего времени, что обеспечивает большую экспериментальную согласованность.

Сообщалось также о других протоколах для изоляции ядер от несшитых скелетных мышц. В двух исследованиях описывалось использование градиентного ультрацентрифугирования для отделения ядер от оставшихся миофибрилл и клеточного мусора ^{23 , 24} . В то время как ультрацентрифугирование сахарозы или коллоидного градиента эффективно с несшитыми мышечными тканями, наши эксперименты показали, что после сшивания градиентное ультрацентрифугирование не позволяет отделить ядра от клетки dEbris на градиенте.

Поэтому мы разработали процедуру выделения высококачественных ядер с использованием сшитых мышечных тканей скелетных мышц. Вместо градиентного ультрацентрифугирования мы разработали метод последовательной фильтрации для эффективного отделения ядер от мусора. После ультразвукового исследования образцы хроматина были успешно применены для исследований ChIP, которые показали циркадную картину связывания белка BMAL1 с целевыми промоторами. Наш метод может быть широко применим для различных механистических исследований мышечных тканей.