Um método baseado na filtração de preparação de núcleos de alta qualidade a partir de músculo esquelético reticulado para imunoprecipitação com cromatina

O músculo esquelético desempenha papéis importantes na fisiologia e no comportamento. A fibra muscular multi-nucleada consiste em miofibrilas onde a actina e a miosina formam unidades funcionais chamadas sarcomeres para gerar força contrátil. O músculo esquelético é também o maior órgão metabólico do corpo, representando> 80% de glicose pós-prandial e regulando a resposta da insulina e a homeostase metabólica ^{1 , 2} . A fisiologia muscular e o metabolismo são rigorosamente regulados pelo relógio circadiano, um temporizador biológico intrínseco ^{3 , 4 , 5 , 6} . Por exemplo, a deleção específica de músculo esquelético de Bmal1 , um dos componentes do relógio circadiano central, resultou em resistência à insulina e diminuição da captação de glicose no músculo esquelético, e os animais desenvolveram diabetes tipo 2 ⁷ . EuAlém disso, o músculo esquelético também é cada vez mais apreciado como um órgão endócrino ⁸ , secretando as mioquinas para regular o metabolismo sistêmico e a fisiologia. Estudos mecânicos são necessários para entender completamente essas funções reguladoras no músculo esquelético.

O ChIP é uma abordagem poderosa para delinear o recrutamento do promotor de proteínas de ligação ao DNA. O ChIP foi inicialmente desenvolvido para identificar a organização dos nucleossomas no DNA da cromatina ^{9 , 10} . Desde então, uma variedade de métodos foram relatados para reticular proteínas e DNA de cromatina usando formaldeído, sulfato de dimetilo ou irradiação ultravioleta (UV) ^{11 , 12} . A reticulação do formaldeído é a mais utilizada, preservando a estrutura da cromatina e as interações DNA-proteína ^{9 , 13 , 14} . Cromatografia cruzadaIn é cortado por sonicação e imunoprecipitado com anticorpo contra a proteína de ligação de DNA particular ^{15 , 16} . Nos últimos anos, a sequenciação de ChIP (ChIP-seq), um método que combina ChIP com NGS, foi desenvolvido para interrogar a ligação ao fator de transcrição do genoma ¹⁷ e, em alguns casos, monitorar mudanças dinâmicas ao longo de um curso de tempo ^{18 , 19 , 20} . Por exemplo, os estudos circadianos de ChIP-seq revelaram uma sequência altamente orquestrada de ligação genômica de componentes do relógio circadiano e marcadores de histonas, o que impulsiona a expressão de genes temporalmente precisa ao longo do ciclo circadiano de aproximadamente 24 h ¹⁸ .

A maioria dos protocolos ChIP disponíveis são projetados para tecidos moles ( por exemplo , fígado, cérebro, etc. ), e muito poucos foram publicados para tecidos duros, incluindo esqueletoMuscular. É tecnicamente desafiador homogeneizar o músculo esquelético rico em fibras e isolar núcleos de alta qualidade ²¹ , especialmente para experiências ChIP que requerem reticulação. Em um recente estudo muscular ChIP ²² , as células satélites foram separadas das miofibras e os núcleos foram preparados a partir de ambos os tipos de células através de um procedimento prolongado envolvendo digestão tecidual. Todo o processo demorou aproximadamente três horas para completar antes que a reticulação de formaldeído fosse realizada em núcleos isolados. Embora este procedimento tenha evitado a fibra muscular de reticulação, o que torna o tecido muscular ainda mais refratário a uma homogeneização eficiente e foi capaz de produzir núcleos de alta qualidade, o tempo significativo de retirada de tecido para reticulação de núcleos incorre o risco de DNA alterado – interação protéica. Em contraste, a maioria dos estudos realizou reticulação imediatamente após o tratamento experimental ou a coleta de tecido para preservar o DNA-protei em tempo realN vinculativo ¹² . Uma segunda desvantagem do isolamento de núcleos antes da reticulação é que ele impede aplicações sensíveis ao tempo, como a coleta de amostras circadianas, que normalmente ocorre em intervalos de 3 a 4 h. Sem reticular os núcleos, o isolamento precisa prosseguir imediatamente após a dissecção, enquanto que as amostras reticuladas podem ser processadas juntas após completar o curso inteiro, garantindo assim uma maior consistência experimental.

Outros protocolos para o isolamento de núcleos de músculo esquelético não reticulado também foram relatados. Dois estudos descreveram o uso de ultracentrifugação em gradiente para separar núcleos de miofibrilos e detritos celulares ^{23 , 24} . Enquanto a sacarose ou a ultracentrifugação de gradiente coloidal é eficaz com tecidos musculares não cruzados, nossas experiências revelaram que após a reticulação, a ultracentrifugação em gradiente não conseguiu separar os núcleos da célula dEbris no gradiente.

Por isso, desenvolvemos um procedimento para isolar núcleos de alta qualidade usando tecidos de músculo esquelético de rato reticulado. Ao invés de ultracentrifugação em gradiente, inventamos um método de filtração em série para separar separadamente núcleos de detritos. Após a ultra-sonografia, as amostras de cromatina foram aplicadas com sucesso para estudos de ChIP, que mostraram um padrão circadiano de ligação da proteína BMAL1 aos promotores alvo. Nosso método pode ser amplamente aplicável a vários estudos mecanicistas de tecidos musculares.