クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法

骨格筋は生理および行動において重要な役割を果たす。多核筋繊維は、アクチンとミオシンが収縮力を発生させる筋節と呼ばれる機能単位を形成する筋原繊維からなる。骨格筋は体内で最大の代謝臓器でもあり、食後のグルコース摂取量が80％を超え、インスリン応答と代謝ホメオスタシスを調節します^1,2 。筋肉の生理および代謝は、内在的な時計である内在的な生物学的タイマー3,4,5,6によって厳密に規制されている。例えば、概日の主要な時計成分の1つであるBmal1の骨格筋特異的欠損は、インスリン抵抗性をもたらし、骨格筋におけるグルコース取り込みを減少させ、動物は2型糖尿病を発症することが判明した⁷ 。私さらに、骨格筋も内分泌臓器⁸として評価され、全身の代謝および生理機能を調節するためにミオシンを分泌する。骨格筋におけるこれらの調節機能を完全に理解するためには、機構的研究が必要である。

ChIPは、DNA結合タンパク質のプロモーター補充を描写するための強力なアプローチである。 ChIPは、最初にクロマチンDNA ^9,10上のヌクレオソーム構成を同定するために開発された。ホルムアルデヒド、硫酸ジメチルまたは紫外線照射（UV） ^11,12を使用してタンパク質およびクロマチンDNAを架橋する様々な方法が報告されている。ホルムアルデヒド架橋は、最も一般的に使用され、クロマチン構造およびDNA-タンパク質相互作用を保存している9,13,14。架橋クロマトグラフィーinを音波処理により細断し、目的の特定のDNA結合タンパク質^15,16に対する抗体で免疫沈降させる。近年、ChIPとNGSを組み合わせたChIP配列決定法（ChIP-seq）は、ゲノム全体の転写因子結合を調べるために開発されており、場合によっては時間経過に伴う動的変化をモニターするために開発されている18,19,20 。例えば、概日ChIP-seq研究は、24時間の概日周期¹⁸にわたって時間的に正確な遺伝子発現を駆動する概日クロック成分およびヒストンマーカーのゲノム結合の高度に調整された配列を明らかにした。

最も入手可能なChIPプロトコルは、軟組織（ 例えば、肝臓、脳など ）用に設計されており、骨格タルマシン。繊維が豊富な骨格筋を均質化し、高品質の核²¹を分離することは技術的に困難であり、特に架橋を必要とするChIP実験の場合には困難である。最近の筋肉ChIP研究²²では、衛星細胞を筋繊維から分離し、核を両方の細胞型から、組織消化を含む長期の手順によって調製した。ホルムアルデヒド架橋が単離された核の上で行われる前に、全工程が完了するまでに約3時間を要した。この手順は、筋肉組織をより効率的な均質化に対して不応性にし、高品質の核を生成することができた筋繊維の架橋を回避したが、組織の収集から核の架橋への有意なタイムラグは、 – タンパク質相互作用。対照的に、ほとんどの研究は、リアルタイムDNA-プロテイムを保存するために、実験的処置または組織回収の直後に架橋を行ったn結合¹² 。架橋前の核単離の第2の欠点は、典型的には3〜4時間間隔で生じる概日検体採取のような時間依存性の適用を排除することである。核を架橋させることなく、解離の直後に単離を進行させる必要があるのに対し、架橋した試料は時間経過全体が完了した後に一緒に処理することができ、実験の一貫性を保証する。

未架橋骨格筋からの核の単離のための他のプロトコールも報告されている。 2つの研究では、勾配超遠心分離を使用して残りの筋原線維および細胞破片から核を分離することが記載されている^23,24 。スクロースまたはコロイド勾配超遠心分離が未架橋筋肉組織に有効である一方で、本発明者らの実験は、架橋後、勾配超遠心分離が細胞dから核を分離することができないことを明らかにしたエブリスはグラデーションに乗っています。

したがって、我々は、架橋マウス骨格筋組織を用いて高品質の核を単離するための手順を開発した。グラジエント超遠心分離ではなく、連続したろ過法を考案し、核を残骸から効果的に分離しました。超音波処理後、クロマチンサンプルは、標的プロモーターに結合するBMAL1タンパク質の概日パターンを示すChIP研究に首尾よく適用された。我々の方法は、筋肉組織の様々な機械的研究に広く適用することができる。