Un metodo basato sulla filtrazione per preparare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico incrociato per l'immunoprecipitazione cromatina

Il muscolo scheletrico gioca un ruolo importante nella fisiologia e nel comportamento. La fibra muscolare multi-nucleata è costituita da miofibri in cui l'actina e la myosina formano unità funzionali chiamate sarcomeri per generare forza contrattile. Il muscolo scheletrico è anche il più grande organo metabolico del corpo, che rappresenta l'assunzione postprandiale del glucosio> 80% e regola la risposta dell'insulina e l'omeostasi metabolica ^{1 , 2} . La fisiologia muscolare e il metabolismo sono strettamente regolamentati dall'orologio circadian, un timer biologico intrinseco ^{3 , 4 , 5 , 6} . Ad esempio, la delezione muscolare-scheletrica di Bmal1 , uno dei principali componenti orologi circadiani, ha determinato una resistenza all'insulina e una riduzione della somministrazione di glucosio nel muscolo scheletrico e gli animali sono stati individuati per sviluppare il diabete di tipo 2 ⁷ . ioInoltre, il muscolo scheletrico è sempre più apprezzato come un organo endocrino ⁸ , secreto le miokine per regolare il metabolismo sistemico e la fisiologia. Studi meccanici sono necessari per comprendere appieno queste funzioni regolatrici nel muscolo scheletrico.

ChIP è un approccio potente per delineare il reclutamento del promotore delle proteine ​​legate al DNA. ChIP è stato inizialmente sviluppato per identificare l'organizzazione dei nucleosomi nel DNA cromatina ^{9 , 10} . Una varietà di metodi sono da allora riportati alle proteine ​​a croce e al cromatin DNA utilizzando formaldeide, dimetilsolfato o irradiazione ultravioletta (UV) ^{11 , 12} . Il cross-linking di formaldeide è la struttura più comunemente utilizzata per la conservazione della cromatina e le interazioni tra DNA e proteine ^{9 , 13 , 14} . Cromatico reticolatoIn è triturata dalla sonicazione e immunoprecipitato con anticorpo contro la particolare proteina legante del DNA di interesse ^{15 , 16} . Negli ultimi anni, il ChIP-sequenza (ChIP-seq), un metodo che unisce ChIP con NGS, è stato sviluppato per interrogare il legame di genitia di fattore di trascrizione ¹⁷ e in alcuni casi per monitorare le variazioni dinamiche su un corso di tempo ^{18 , 19 , 20} . Ad esempio, gli studi circadiani ChIP-seq hanno rivelato una sequenza altamente orchestrata di legame genomico dei componenti dell'orologio circadiano e dei marcatori istoni, che conduce un'espressione genica precisa in tutto il ciclo circadian 24 h.

La maggior parte dei protocolli ChIP disponibili sono progettati per i tessuti molli ( ad es. Fegato, cervello, ecc. ) E pochissimi sono stati pubblicati per tessuti duri, tra cui scafoTal muscolo. È tecnicamente impegnativo per omogeneizzare i muscoli scheletrici ricchi di fibre e isolare nuclei di alta qualità ²¹ , specialmente per gli esperimenti ChIP che richiedono un collegamento incrociato. In un recente studio muscolo ChIP ²² , le cellule satellitari sono state separate da miofibere e nuclei sono stati preparati da entrambi i tipi di cellule attraverso una prolungata procedura che coinvolge la digestione tissutale. L'intero processo ha richiesto circa tre ore per completare prima che la fusione di formaldeide sia stata eseguita su nuclei isolati. Mentre questa procedura evitava la creazione di fibre muscolari incrociate, rendendo il tessuto muscolare ancora più refrattario per un'efficace omogeneizzazione ed è stato in grado di produrre nuclei di alta qualità, il significativo tempo trascorso dalla raccolta dei tessuti ai reticolazione dei nuclei comporta il rischio di alterato DNA -interazione tra proteine. Al contrario, la maggior parte degli studi ha effettuato la reticolazione immediatamente dopo il trattamento sperimentale o la raccolta dei tessuti al fine di preservare le proteine ​​del DNA in tempo realeN vincolante ¹² . Un secondo inconveniente dell'isolamento del nucleo prima della connessione incrociata è che preclude applicazioni sensibili al tempo come ad esempio la raccolta di campioni circadiani che si presenta tipicamente a intervalli di 3 – 4 ore. Senza incrociare i nuclei, l'isolamento deve proseguire immediatamente dopo la dissezione, mentre campioni reticolati possono essere elaborati insieme dopo l'intero ciclo di tempo completato, garantendo così una maggiore consistenza sperimentale.

Sono stati inoltre riportati altri protocolli per l'isolamento del nucleo da muscoli scheletrici non rettangolari. Due studi hanno descritto l'utilizzo di ultracentrifugazione gradiente a nuclei separati da residui di miopi e detriti cellulari ^{23 , 24} . Mentre il saccarosio o l'ultracentrifugazione a gradiente colloidale sono efficaci con i tessuti muscolari non rettilineati, i nostri esperimenti hanno rivelato che dopo il reticolazione, l'ultracentrifugazione di gradiente non è riuscita a separare i nuclei dalla cella dEbris sul gradiente.

Abbiamo quindi sviluppato una procedura per isolare nuclei di alta qualità usando tessuti muscolari scheletriche a croce. Piuttosto che l'ultracentrifugazione gradiente, abbiamo elaborato un metodo di filtrazione seriale per separare efficacemente i nuclei dai detriti. Dopo l'ultrasonografia, i campioni di cromatina sono stati applicati con successo per gli studi di ChIP che hanno mostrato un pattern circadiano di proteina BMAL1 legato ai promotori di bersaglio. Il nostro metodo può essere generalmente applicabile a vari studi meccanici dei tessuti muscolari.