שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין
Summary
אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סינון לבודד גרעינים באיכות גבוהה מן הצלב המקושרים שריר השלד העכבר שבו הסרנו את הצורך ultracentrifugation, מה שהופך אותו ישים בקלות. אנו מראים כי הכרומטין מוכן מן הגרעינים מתאים immunoprecipitation הכרומטין וסביר הכרומטין immunoprecipitation רצף מחקרים.
Abstract
Chromatin immunoprecipitation (שבב) היא שיטה רבת עוצמה כדי לקבוע מחייב חלבון ל- DNA הכרומטין. שריר השלד עשיר, עם זאת, כבר אתגר עבור שבב עקב קושי טכני בבידוד של גרעינים באיכות גבוהה עם זיהום מינימלי של myofibrils. פרוטוקולים קודמים ניסו לטהר גרעינים לפני הצלב המקשר, אשר נוטל את הסיכון של אינטראקציה DNA- חלבון השתנה במהלך תהליך הכנת גרעינים ממושכים. בפרוטוקול הנוכחי, אנחנו הראשונים לחצות את רקמת שריר השלד שנאספו עכברים, ואת הרקמות היו minced ו sonicated. מאז מצאנו כי ultracentrifugation לא היה מסוגל להפריד בין גרעינים מ myofibrils באמצעות צולבות צלב רקמות, אנו המציא הליך סינון רציף כדי להשיג גרעינים באיכות גבוהה ללא נטילת myofibril משמעותי. לאחר מכן הכינו הכרומטין באמצעות ultrasonicator, מבחני שבב עם נוגדן אנטי BMAL1 חשף מחייב היממה חזקדפוס של BMAL1 למקדמי הגן. פרוטוקול סינון זה מהווה שיטה הניתנת להחלה בקלות על מנת לבודד גרעינים באיכות גבוהה מרקמת שריר השלד הצולבת, ומאפשר עיבוד דגימה עקבי ללימודים היומיים והרגישים לזמן. בשילוב עם הדור הבא רצף (NGS), השיטה שלנו ניתן לפרוס למחקרים מכניסטיים גנומי שונים התמקדות תפקוד שרירי השלד.
Introduction
שריר השלד משחק תפקידים חשובים בפיזיולוגיה והתנהגות. סיבי השריר רב נוקלאציה מורכבת myofibrils שבו אקטין ו מיוסין טופס יחידות פונקציונליות קרא sarcomeres לייצר כוח התכווצות. שריר השלד הוא גם האיבר המטבולי הגדול ביותר בגוף, חשבונאות עבור 80% לאחר גלוקוז הכנסה הכנסה ותגובה התגובה אינסולין הומאוסטזיס מטבולית 1 , 2 . פיזיולוגיה של שרירים ומטבוליזם מוסדרים היטב על ידי השעון היממה, שעון ביולוגי פנימי 3 , 4 , 5 , 6 . לדוגמה, המחיקה הספציפית של שריר השלד של Bmal1 , אחד מרכיבי שעון היממה המרכזיים, הביאה להתנגדות לאינסולין ולצמצום ספיגת גלוקוז בשרירי השלד, והחיות נמצאו לפתח סוכרת מסוג 2. אניבנוסף, שריר השלד הוא גם יותר ויותר להיות מוערך כמו איבר אנדוקריני 8 , מפריש myocines כדי להסדיר מטבוליזם מערכתית ופיזיולוגיה. מחקרים מכניקים נדרשים כדי להבין את הפונקציות הרגולטוריות הללו בשרירי השלד.
שבב הוא גישה רבת עוצמה כדי לגבש גיוס האמרגן של חלבונים דנה מחייב. שבב פותחה לראשונה כדי לזהות ארגון nucleosome על הכרומטין DNA 9 , 10 . מגוון של שיטות מאז דווחו לחצות חלבונים ו DNA הכרומטין באמצעות פורמלדהיד, דימתיל סולפט או אולטרה סגול הקרנה (UV) 11 , 12 . פורמלדהיד cross-linking הוא הנפוץ ביותר, שמירה על מבנה הכרומטין ו- DNA חלבונים אינטראקציות 9 , 13 , 14 . כרומט צולבב הוא מגורר על ידי sonication ו immunoprecipitated עם נוגדן נגד חלבון מסוים DNA מחייב עניין 15 , 16 . בשנים האחרונות פותחה שיטת השבב (CHIP-seq), שיטה המשלבת שבב עם NGS, לחקירת גורם שעתוק בגנום רחב 17 , ובמקרים מסוימים גם לעקוב אחר שינויים דינמיים במהלך קורס 18 , 19 , 20 . לדוגמה, מחקרים שבב-שבב seq חשפו רצף מתוזמר מאוד של מחייב גנומי של רכיבי שעון היממה ואת סמנים היסטון, אשר מניע ביטוי גנטי מדויק timporally לאורך ~ 24 שעות מחזור היממה 18 .
פרוטוקולי השבבים הזמינים ביותר מיועדים לרקמות רכות ( למשל , כבד, מוח וכו ' ), ומעט מאוד פורסמו עבור רקמות קשות כולל סקלהשריר. זה מאתגר מבחינה טכנית כדי homogenize סיבים שריר השלד עשיר לבודד גרעינים באיכות גבוהה 21 , במיוחד עבור ניסויים שבב הדורשים cross- המקשר. במחקר שבץ שריר שנערך לאחרונה, 22 הופרדו תאי לוויין מהמיוביבים, וגרעינים הוכנו משני סוגי התאים באמצעות הליך ממושך של עיכול רקמות. התהליך כולו לקח כשלוש שעות כדי להשלים לפני פורמלדהיד cross-linking בוצע על גרעינים מבודדים. בעוד פרוצדורה זו נמנעת בין סיבי השריר המקושרים, מה שהופך את רקמת השריר אפילו יותר עקשן להומוגניזציה יעילה, והיה מסוגל לייצר גרעינים באיכות גבוהה, פיגור הזמן המשמעותי מאוסף רקמות לגרעינים מקושרים את הסיכון ל- DNA שונה אינטראקציה בין פרוטאינים. לעומת זאת, רוב המחקרים ביצעו קישור צולב מיד לאחר טיפול ניסיוני או אוסף רקמות על מנת לשמר את ה- DNA בזמן אמת חלבוניםכריכה 12 . חיסרון שני של בידוד גרעיני לפני cross-linking היא כי זה מונע זמן רגיש יישומים כגון אוסף מדגם היממה אשר בדרך כלל מתרחשת במרווחים 3 – 4 שעות. בלי לחצות את הגרעינים, הבידוד צריך להתקדם מיד לאחר לנתיחה, ואילו דגימות צולבות ניתן לעבד יחד לאחר כל הקורס הזמן הושלמה, ובכך להבטיח עקביות ניסויית יותר.
פרוטוקולים אחרים לבידוד גרעינים מ שריר השלד unrosslinked דווחו גם. שני מחקרים תיארו את השימוש ultracentrifugation הדרגתי לגרעינים נפרדים מן הנותרים myofibrils ופסולת 23 , 24 . בעוד סוכרת או collucal colloundal gradientugugation הדרגתי יעיל עם רקמות שריר uncrosslinked, הניסויים שלנו גילה כי לאחר crosslinking, ultracentrifugation הדרגתי נכשל להפריד בין גרעיני תא DEbris על שיפוע.
לכן פיתחנו נוהל לבידוד גרעינים באיכות גבוהה תוך שימוש ברקמות שריר השלד. במקום ultcentrifugugation הדרגתי, אנו המציא שיטת סינון סדרתי ביעילות נפרד גרעינים מן פסולת. בעקבות ultrasonication, דגימות הכרומטין יושמו בהצלחה למחקרים שבב אשר הראו דפוס היממה של חלבון BMAL1 מחייב למקד מקדמי. השיטה שלנו יכולה להיות חלים באופן נרחב על מחקרים מכניסטיים שונים של רקמות השריר.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה חזקה שבה צולבות רקמות שריר השלד שימשו לבודד גרעינים באיכות גבוהה. סינון רציף בוצע על מנת להפריד באופן יעיל גרעינים מן פסולת, ואנרגיה אקוסטית קולי מן מתכון בצורת צלחת גזז את הכרומטין לניתוח CHIP. התוצאות הראו מחייב זמן ספציפי היממה של BMAL1 למקדמים היזמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Karyn אסר, נובויה Koike ו Noheon פארק עצה מועילה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי NIH / NIGMS (R01GM114424) ל- S.-HY, ו- Robert A. Welch Foundation (AU-1731) ו- NIH / NIA (R01AG045828) ל- ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
