Eine Filtrations-basierte Methode zur Herstellung von hochwertigen Nuklei aus vernetzten Skelettmuskeln für Chromatin-Immunpräzipitation

Skelettmuskel spielt eine wichtige Rolle in Physiologie und Verhalten. Die mehrkernige Muskelfaser besteht aus Myofibrillen, in denen Aktin und Myosin funktionale Einheiten bilden, die Sarkomere genannt werden, um kontraktile Kraft zu erzeugen. Skelettmuskel ist auch das größte Stoffwechselorgan im Körper, das für> 80% postprandiale Glukoseaufnahme und regulierende Insulinreaktion und metabolische Homöostase ^{1 , 2 verantwortlich ist} . Die Muskelphysiologie und der Stoffwechsel werden durch die zirkadiane Uhr, einen intrinsischen biologischen Timer ^{3 , 4 , 5 , 6,} genau reguliert. Zum Beispiel führte die Skelettmuskelspezifische Deletion von Bmal1 , einer der Kern-zirkadianen Taktkomponenten , zu einer Insulinresistenz und einer verminderten Glukoseaufnahme im Skelettmuskel, und die Tiere wurden gefunden, um Typ-2-Diabetes ^{7 zu entwickeln} . ichNeben der Skelettmuskulatur wird auch zunehmend ein endokrines Organ ⁸ geschätzt, das Myokine sekretiert, um den systemischen Stoffwechsel und die Physiologie zu regulieren. Mechanistische Studien sind erforderlich, um diese regulatorischen Funktionen im Skelettmuskel vollständig zu verstehen.

ChIP ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Abgrenzung der Promotorrekrutierung von DNA-bindenden Proteinen. ChIP wurde ursprünglich entwickelt, um die Nukleosomenorganisation auf Chromatin-DNA ^{9 , 10} zu identifizieren. Es wurde bisher eine Vielzahl von Verfahren zur Vernetzung von Proteinen und Chromatin-DNA unter Verwendung von Formaldehyd, Dimethylsulfat oder Ultraviolettbestrahlung (UV) ^{11 , 12 beschrieben} . Die Formaldehyd-Vernetzung ist die am häufigsten verwendete, konservierende Chromatinstruktur und DNA-Protein-Wechselwirkungen ^{9 , 13 , 14} . Vernetztes ChromatIn wird durch Beschallung zerkleinert und mit Antikörper gegen das jeweilige DNA-bindende Protein von Interesse ^{15 , 16} immunpräzipitiert. In den letzten Jahren wurde die ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq), eine Methode, die ChIP mit NGS kombiniert, entwickelt, um die genomweite Transkriptionsfaktorbindung ^{17 zu untersuchen} und in einigen Fällen die dynamischen Veränderungen über einen Zeitverlauf ^{18 , 19 , 20} zu überwachen . Zum Beispiel haben zirkadiane ChIP-seq-Studien eine hochorchestrierte Sequenz der genomischen Bindung von zirkadianen Taktkomponenten und Histonmarkern, die eine zeitlich präzise Genexpression während des gesamten 24h-zirkadischen Zyklus ¹⁸ antreibt.

Die meisten verfügbaren ChIP-Protokolle sind für Weichgewebe ( zB Leber, Gehirn, etc. ) konzipiert, und nur sehr wenige wurden für harte Gewebe einschließlich Skele veröffentlichtTal muskel Es ist technisch anspruchsvoll, den faserreichen Skelettmuskel zu homogenisieren und die hochwertigen Kerne ^{21 zu} isolieren, insbesondere für ChIP-Experimente, die eine Vernetzung erfordern. In einer neueren Muskel-ChIP-Studie ²² wurden Satelliten-Zellen von Myofasern getrennt, und die Kerne wurden aus beiden Zelltypen durch ein verlängertes Verfahren mit Gewebeverdauung hergestellt. Der gesamte Prozeß dauerte etwa drei Stunden, bis die Formaldehyd-Vernetzung an isolierten Kernen durchgeführt wurde. Während dieses Verfahren eine vernetzte Muskelfaser vermeidet, die das Muskelgewebe für eine effiziente Homogenisierung noch widerstandsfähiger macht und in der Lage war, qualitativ hochwertige Kerne herzustellen, entsteht die signifikante Zeitverzögerung von der Gewebsansammlung zur Keimvernetzung das Risiko einer veränderten DNA -protein-interaktion Im Gegensatz dazu führten die meisten Studien eine Vernetzung unmittelbar nach der experimentellen Behandlung oder Gewebesammlung durch, um das Echtzeit-DNA-Protei zu erhaltenN Bindung ¹² Ein zweiter Nachteil der Kerneisolation vor der Vernetzung besteht darin, dass sie zeitempfindliche Anwendungen wie zirkadiane Probensammlungen ausschließt, die typischerweise in Intervallen von 3 – 4 h auftreten. Ohne Vernetzung der Kerne muss die Isolierung unmittelbar nach der Sezierung erfolgen, während vernetzte Proben nach Beendigung des gesamten Zeitverlaufs zusammen verarbeitet werden können, so dass eine größere experimentelle Konsistenz gewährleistet ist.

Andere Protokolle für die Kernenisolation aus dem unvernetzten Skelettmuskel wurden ebenfalls berichtet. Zwei Studien beschreiben die Verwendung von Gradienten-Ultrazentrifugation, um Kerne von verbleibenden Myofibrillen und Zelltrümmern ^{23 , 24} zu trennen. Während die Saccharose- oder Kolloidgradienten-Ultrazentrifugation mit unvernetzten Muskelgeweben wirksam ist, zeigten unsere Experimente, dass nach der Vernetzung die Gradienten-Ultrazentrifugation die Kerne nicht von der Zelle d trennteEbris auf dem gradienten

Wir haben daher ein Verfahren entwickelt, um qualitativ hochwertige Kerne unter Verwendung von vernetzten Maus-Skelettmuskelgeweben zu isolieren. Statt der Gradienten-Ultrazentrifugation haben wir eine serielle Filtrationsmethode entwickelt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Chromatinproben erfolgreich für ChIP-Studien angewendet, die ein zirkadianes Muster der BMAL1-Proteinbindung an Ziel-Promotoren zeigten. Unsere Methode kann breit auf verschiedene mechanistische Studien von Muskelgeweben anwendbar sein.