Une méthode à base de filtration pour la préparation de noyaux de haute qualité à partir d'un muscle squelettique réticulé pour l'immunoprécipitation de la chromatine

Le muscle squelettique joue un rôle important dans la physiologie et le comportement. La fibre musculaire multi-nucléée se compose de myofibrilles où l'actine et la myosine forment des unités fonctionnelles appelées sarcomères pour générer une force contractile. Le muscle squelettique est également le plus grand organe métabolique du corps, ce qui représente> 80% d'apport de glucose postprandial et de régulation de la réponse à l'insuline et de l'homéostasie métabolique ^{1 , 2} . La physiologie musculaire et le métabolisme sont étroitement réglementés par l'horloge circadienne, une minuterie biologique intrinsèque ^{3 , 4 , 5 , 6} . Par exemple, la suppression spécifique du muscle squelettique de Bmal1 , l'un des composants de l'horloge circadienne centrale, a entraîné une résistance à l'insuline et une diminution de l'absorption du glucose dans le muscle squelettique, et on a constaté que les animaux développaient un diabète de type 2 ⁷ . jeEn outre, le muscle squelettique est de plus en plus apprécié en tant qu'organe endocrinien ⁸ , sécrétant les myokines pour réguler le métabolisme systémique et la physiologie. Des études mécanistiques sont nécessaires pour bien comprendre ces fonctions réglementaires dans le muscle squelettique.

ChIP est une approche puissante pour délimiter le recrutement par le promoteur de protéines de liaison à l'ADN. ChIP a d'abord été développé pour identifier l'organisation des nucléosomes sur l'ADN de la chromatine ^{9 , 10} . Depuis, on a signalé que diverses méthodes ont réticulé les protéines et l'ADN de la chromatine en utilisant du formaldéhyde, du sulfate de diméthyle ou de l'irradiation ultraviolette (UV) ^{11 , 12} . La réticulation du formaldehyde est la structure la plus utilisée, la structure de la chromatine et les interactions ADN-protéine ^{9 , 13 , 14} . Chromatographie réticuléeIn est déchiqueté par sonication et immunoprécipité avec un anticorps contre la protéine de liaison d'ADN spécifique ^{15 , 16} . Au cours des dernières années, le séquençage par ChIP (ChIP-seq), une méthode combinant ChIP avec NGS, a été développé pour interroger le facteur de transcription du génome à l'échelle du ¹⁷ et, dans certains cas, pour surveiller les changements dynamiques au cours d'un cours ^{18 , 19 , 20} . Par exemple, les études circadiennes ChIP-seq ont révélé une séquence hautement orchestrée de liaison génomique des composants de l'horloge circadienne et des marqueurs d'histones, ce qui entraîne une expression du gène temporellement précise tout au long du cycle circadien de 24 heures ¹⁸ .

La plupart des protocoles ChIP disponibles sont conçus pour les tissus mous ( par exemple, le foie, le cerveau, etc. ) et très peu ont été publiés pour les tissus durs, y compris le squeletteMuscle. Il est techniquement difficile d'homogénéiser le muscle squelettique riche en fibres et d'isoler les noyaux de haute qualité ²¹ , en particulier pour les expériences ChIP qui nécessitent une réticulation. Dans une récente étude sur le muscle ChIP ²² , les cellules satellites ont été séparées des myofibres et des noyaux ont été préparés à partir des deux types de cellules par une procédure prolongée impliquant une digestion des tissus. L'ensemble du processus a duré environ trois heures avant de procéder à la réticulation du formaldéhyde sur des noyaux isolés. Bien que cette procédure ait évité de reticuler la fibre musculaire, ce qui rend le tissu musculaire encore plus réfractaire à une homogénéisation efficace et a pu produire des noyaux de haute qualité, le retard important de la collecte des tissus à la réticulation des noyaux entraîne le risque d'ADN altéré -interaction des protéines. En revanche, la plupart des études ont réalisé une réticulation immédiatement après un traitement expérimental ou une collecte de tissu afin de préserver l'ADN-protéi en temps réelN liaison ¹² . Un deuxième inconvénient de l'isolement des noyaux avant la réticulation est qu'il empêche les applications sensibles au temps telles que la collecte d'échantillon circadien qui se produit habituellement à des intervalles de 3 à 4 h. Sans reticuler les noyaux, l'isolement doit se dérouler immédiatement après la dissection, alors que les échantillons réticulés peuvent être traités ensemble après la fin du cours, ce qui garantit une plus grande cohérence expérimentale.

D'autres protocoles pour l'isolement des noyaux à partir de muscle squelettique non réticulé ont également été rapportés. Deux études ont décrit l'utilisation de l'ultracentrifugation en gradient pour séparer les noyaux des myofibrilles restantes et des débris cellulaires ^{23 , 24} . Alors que le sucrose ou l'ultracentrifugation en gradient colloïdal est efficace avec les tissus musculaires non réticulés, nos expériences ont révélé qu'après la réticulation, l'ultracentrifugation en gradient n'a pas réussi à séparer les noyaux de la cellule dEbris sur le dégradé.

Nous avons donc développé une procédure pour isoler des noyaux de haute qualité en utilisant des tissus de muscle squelettique de souris réticulés. Plutôt que de l'ultracentrifugation en gradient, nous avons conçu une méthode de filtration en série pour séparer efficacement les noyaux des débris. À la suite de l'échographie, les échantillons de chromatine ont été appliqués avec succès pour des études de ChIP qui ont montré un schéma circadien de liaison de la protéine BMAL1 aux promoteurs cibles. Notre méthode peut être largement applicable à diverses études mécanistes des tissus musculaires.