Een filtratie-gebaseerde methode om hoogwaardige kernen uit kruisgebonden skeletspier voor chromatine immunoprecipitatie te bereiden
Summary
Wij presenteren een protocol op basis van filtratie om hoogwaardige kernen te isoleren van de cross-linked museskeletspier waarbij we de behoefte aan ultracentrifugatie hebben verwijderd, waardoor het gemakkelijk toepasbaar is. We laten zien dat chromatine bereid uit de kernen geschikt is voor chromatine immunoprecipitatie en waarschijnlijk chromatin immunoprecipitatie sequencing studies.
Abstract
Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtige methode om eiwitbinding aan chromatine DNA te bepalen. Vezelrijke skeletspier is echter een uitdaging voor ChIP door technische moeilijkheden in isolatie van hoogwaardige kernen met minimale verontreiniging van myofibrillen. Vorige protocollen hebben geprobeerd nuclei te zuiveren alvorens te verbinden, wat het risico op veranderde DNA-eiwitinteractie tijdens het langdurige nucleaire bereidingsproces oplevert. In het huidige protocol hebben we eerst het skeletspierweefsel dat uit muizen is verzameld, versterkt en de weefsels werden gehakt en gesoneerd. Aangezien we ontdekten dat ultracentrifugatie niet in staat was kernen uit myofibrillen te scheiden met behulp van verknoopt spierweefsel, hebben we een sequentiële filtratieprocedure ontwikkeld om kwalitatief hoogstaande kernen te verkrijgen zonder significante myofibrilverontreiniging. Vervolgens bereidden we chromatine door gebruik te maken van een ultrasonicator, en ChIP assays met anti-BMAL1 antilichaam onthulde robuuste circadiaanse bindingPatroon van BMAL1 om genpromotoren te targeten. Dit filtratieprotocol vormt een gemakkelijk toepasbare methode om kwalitatief hoogwaardige kernen te isoleren uit kruisgebonden skeletspierweefsel, waardoor consistente monstervoorbereiding voor circadiaanse en andere tijdgevoelige studies mogelijk is. In combinatie met volgende generatie sequencing (NGS) kan onze methode worden ingezet voor diverse mechanistische en genomische studies die zich richten op de spierfunctie.
Introduction
Skeletspieren spelen belangrijke rol in fysiologie en gedrag. De multi-nucleated spiervezel bestaat uit myofibrillen waar actine en myosine functionele eenheden vormen die sarcomeren noemen om contractiele kracht te genereren. Skeletspier is ook het grootste metabolische orgaan in het lichaam, met als resultaat> 80% postprandiale glucose-inname en het reguleren van insuline respons en metabolische homeostase 1 , 2 . Spierfysiologie en metabolisme worden nauw geregeld door de circadiaanse klok, een intrinsieke biologische timer 3 , 4 , 5 , 6 . Bijvoorbeeld, de skeletspierspecifieke deletie van Bmal1 , een van de kerncircadische klokcomponenten, resulteerde in insulineresistentie en verminderde glucoseopname in de skeletspier, en de dieren bleken type 2-diabetes te ontwikkelen 7 . ikN aanvulling wordt de skeletspier ook steeds meer gewaardeerd als een endocriene orgaan 8 , die myokines uitscheidt om systemisch metabolisme en fysiologie te reguleren. Mechanistische studies zijn nodig om deze regulerende functies in de skeletspieren volledig te begrijpen.
ChIP is een krachtige aanpak voor het werven van DNA-bindende eiwitten. ChIP werd aanvankelijk ontwikkeld om nucleosoomorganisatie op chromatine DNA 9 , 10 te identificeren. Verschillende methoden zijn sindsdien gemeld aan crosslink-eiwitten en chromatine-DNA met behulp van formaldehyde, dimethylsulfaat of ultraviolette bestraling (UV) 11 , 12 . Formaldehyde verknoping is de meest gebruikte, conserverende chromatine structuur en DNA-eiwit interacties 9 , 13 , 14 . Cross-linked chromatografieIn wordt gesnipperd door sonicatie en immunoprecipiteerd met antilichaam tegen het specifieke DNA bindende eiwit van belang 15 , 16 . In de afgelopen jaren is ChIP-sequencing (ChIP-seq), een methode die ChIP combineert met NGS, ontwikkeld om genoom-brede transcriptiefactorbinding 17 te ondervragen en in sommige gevallen dynamische veranderingen te bewaken over een tijdschool 18 , 19 , 20 . Bijvoorbeeld hebben circadiaanse ChIP-seq-studies een zeer georkestreerde sequentie van genomische binding van circadiaanse klokcomponenten en histonmarkers aangetoond, die tijdelijk nauwkeurige genexpressie in de 24 uur circadiacyclus 18 verricht .
De meeste beschikbare ChIP-protocollen zijn ontworpen voor zachte weefsels ( bijv. Lever, hersenen, enz. ) En zeer weinig zijn gepubliceerd voor harde weefsels, waaronder skeleTal spier. Het is technisch uitdagend om vezelrijke skeletspieren te homogeniseren en hoogwaardige kernen 21 te isoleren, vooral voor ChIP-experimenten die kruisverbindingen vereisen. In een recente ChIP-studie 22 van de spier werden satellietcellen gescheiden van myofibers, en kernen werden bereid uit beide celtypes door middel van een langdurige procedure waarbij weefselvertering bestond. Het gehele proces duurde ongeveer drie uur om te voltooien voordat formaldehyde verknoping werd uitgevoerd op geïsoleerde kernen. Terwijl deze procedure vermijdt spiervezels crosslinken, waardoor spierweefsel nog meer vuurvast is tegen efficiënte homogenisatie en in staat was hoge kwaliteitskernen te produceren, veroorzaakt de significante tijdsverlaging van weefselverzameling naar nucleïne-crosslinking het risico op veranderd DNA -proteïne interactie. In tegenstelling hiermee hebben de meeste studies onmiddellijk na experimentele behandeling of weefselverzameling crosslinking uitgevoerd om de real-time DNA-protei te behoudenN bindend 12 . Een tweede nadeel van nucleïneisolatie voor kruisverbindingen is dat het tijdsgevoelige toepassingen voorkomt, zoals circadiaanvangsverzameling die typisch voorkomt bij intervallen van 3 – 4 uur. Zonder de kernen te verbinden, moet de isolatie direct na dissectie doorgaan, terwijl de cross-linked monsters samen kunnen worden verwerkt nadat de volledige tijdsoort is afgerond, waardoor de experimentele consistentie groter wordt.
Andere protocollen voor nucleïneisolatie van ongekruiste skeletspier zijn ook gemeld. Twee studies beschrijven het gebruik van gradiënt-ultracentrifugatie om scheidende kernen te scheiden van overgebleven myofibrillen en celresten 23 , 24 . Terwijl sukrose of colloïdale gradiënt ultracentrifugatie effectief is met ongekruiste spierweefsels, hebben onze experimenten aangetoond dat na de verknoping van de gradiënt de gradiënt ultracentrifugatie niet in staat was kernen van cel d te scheidenEbris op de gradiënt.
We hebben daarom een procedure ontwikkeld om kwalitatief hoogwaardige kernen te isoleren met behulp van kruisgebonden spierweefsels van het skelet. In plaats van de ultracentrifugatie van de gradiënt, hebben we een seriefiltreringsmethode ontwikkeld om de kernen van puin effectief te scheiden. Na ultrasonicatie werden de chromatinmonsters succesvol toegepast voor ChIP-studies, die een circadiaan patroon van BMAL1-eiwitbinding aan doelpromotors toonden. Onze methode kan breed toepasselijk zijn op diverse mechanistische studies van spierweefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een robuuste methode waarbij crosslinked skeletspierweefsels werden gebruikt om hoge kwaliteit kernen te isoleren. Sequentiële filtratie werd uitgevoerd om de kernen effectief te scheiden van puin en ultrasone akoestische energie van schotelvormige transducer scheurde de chromatine voor ChIP analyse. De resultaten toonden circadia-tijdspecifieke binding van BMAL1 aan doelpromotoren.
ChIP kan worden gebruikt om real-time eiwit bezetting op genomisch DNA vast te leggen wan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Karyn Esser, Nobuya Koike en Noheon Park voor behulpzaam advies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH / NIGMS (R01GM114424) aan S.-HY, en de Robert A. Welch Foundation (AU-1731) en NIH / NIA (R01AG045828) naar ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
