A طريقة الترشيح القائم على إعداد نوى عالية الجودة من عبر ربط العضلات والهيكل العظمي للكروماتين مناعي
Summary
نقدم بروتوكول القائمة على الترشيح لعزل نوى ذات جودة عالية من عبر ربط الماوس العضلات والهيكل العظمي حيث أزلنا الحاجة لتنبيذ فائق، مما يجعلها قابلة للتطبيق بسهولة. وتبين لنا أن الكروماتين أعدت من نوى مناسبة للكروماتين مناعي ودراسات تسلسل مناعي لونين المرجح.
Abstract
الكروماتين مناعي (رقاقة) هو وسيلة قوية لتحديد البروتين ملزم الحمض النووي الكروماتين. ومع ذلك، فقد كانت العضلات الهيكلية الغنية بالألياف تحديا ل تشيب بسبب صعوبة تقنية في عزل نوى ذات جودة عالية مع الحد الأدنى من التلوث من ميوفيبريلز. وقد حاولت البروتوكولات السابقة لتنقية النوى قبل عبر ربط، مما يتكبد خطر تغير التفاعل الحمض النووي البروتين خلال عملية إعداد النوى لفترات طويلة. في البروتوكول الحالي، ونحن أولا عبر ربط الأنسجة العضلية والهيكل العظمي التي تم جمعها من الفئران، وكانت مفروم الأنسجة و سونيكاتد. منذ وجدنا أن تنبيذ فائق لم يكن قادرا على فصل نوى من ميوفيبريلز باستخدام الأنسجة العضلية عبر ربط، وضعنا إجراء الترشيح متتابعة للحصول على نوى عالية الجودة خالية من التلوث ميوفيبريل كبير. أعدنا في وقت لاحق لونين باستخدام أولتراسونيكاتور، ومقايسات رقاقة مع مكافحة الأجسام المضادة BMAL1 كشف قوية الإيقاعية ملزمةنمط BMAL1 لاستهداف المروجين الجينات. ويشكل بروتوكول الترشيح هذا طريقة قابلة للتطبيق بسهولة لعزل نوى عالية الجودة من الأنسجة العضلية الهيكلية عبر ربط، مما يسمح معالجة عينة متسقة للدراسات الساعة البيولوجية الحساسة وغيرها من الوقت. في تركيبة مع الجيل المقبل من التسلسل (نغس)، ويمكن نشر طريقتنا لمختلف الدراسات الميكانيكية والجينومية مع التركيز على وظيفة العضلات والهيكل العظمي.
Introduction
العضلات الهيكلية تلعب أدوارا مهمة في علم وظائف الأعضاء والسلوك. تتكون الألياف العضلية متعددة الأنوية من الليفي العضلي حيث وحدات أكتين وميوسين وظيفية تسمى ساركوميريز لتوليد قوة مقلص. العضلات والهيكل العظمي هو أيضا أكبر جهاز التمثيل الغذائي في الجسم، وهو ما يمثل> 80٪ تناول الجلوكوز بعد الأكل وتنظيم استجابة الأنسولين والتمثيل الغذائي التمثيل الغذائي 1 ، 2 . وينظم علم وظائف الأعضاء العضلات والتمثيل الغذائي عن كثب من قبل الساعة البيولوجية، وهو توقيت البيولوجي الجوهري 3 ، 4 ، 5 ، 6 . على سبيل المثال، أدى الحذف الخاص بالهيكل العظمي الخاص بالعضلات Bmal1 ، أحد مكونات الساعة اليومية الأساسية، إلى مقاومة الإنسولين وانخفاض امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية، وتم العثور على الحيوانات لتطوير داء السكري من النوع الثاني 7 . أنان بالإضافة إلى ذلك، يتم أيضا على نحو متزايد يجري تقدير العضلات والهيكل العظمي باعتباره جهاز الغدد الصماء 8 ، إفراز ميوكينس لتنظيم الأيض النظامية وعلم وظائف الأعضاء. مطلوب دراسات آلية لفهم كامل هذه الوظائف التنظيمية في العضلات والهيكل العظمي.
رقاقة هو نهج قوي لتحديد مروج توظيف الحمض النووي ملزم البروتينات. تم تطوير رقاقة في البداية لتحديد منظمة نوكليوسوم على الحمض النووي الكروماتين 9 ، 10 . وقد تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من الأساليب لربط عبر البروتينات والحمض النووي الكروماتين باستخدام الفورمالديهايد، كبريتات ثنائي ميثيل أو الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) 11 ، 12 . الفورمالديهايد عبر ربط هو الأكثر استخداما، والحفاظ على بنية الكروماتين والتفاعلات الحمض النووي البروتين 9 ، 13 ، 14 . كرومات متصالبةفي تمزيقه بواسطة سونيكاتيون و إمونوبريسيبيتاتد مع الأجسام المضادة ضد بروتين ملزمة الحمض النووي محددة من الفائدة 15 ، 16 . في السنوات الأخيرة، تم تطوير رقاقة رقاقة (تشيب-سيق)، وهي طريقة تجمع بين رقاقة مع نغس، لاستجواب عامل النسخ على نطاق الجينوم ملزمة 17 ، وفي بعض الحالات لمراقبة التغيرات الديناميكية على مدى دورة بالطبع 18 ، 19 ، 20 . على سبيل المثال، وقد كشفت الدراسات التي أجريت على رقاقة تشيق سيقان جدا تسلسل مدبرة للغاية من ملزمة الجينومية لمكونات الساعة البيولوجية الساعة هيستون علامات، والذي يدفع مؤقتا التعبير الجيني دقيقة طوال دورة 24 ساعة ~ ساعة البيولوجية 18 .
تم تصميم معظم بروتوكولات رقاقة المتاحة للأنسجة الرخوة ( مثل الكبد والدماغ، وما إلى ذلك )، وعدد قليل جدا تم نشرها للأنسجة الصلبة بما في ذلك سكيلالعضلات. فمن الناحية الفنية تحدي تجانس الألياف الغنية بالهيكل العظمي العضلات وعزل نوى عالية الجودة 21 ، وخاصة بالنسبة للتجارب رقاقة التي تتطلب عبر ربط. في دراسة رقاقة العضلات الأخيرة 22 ، تم فصل الخلايا الأقمار الصناعية من ميوفيبرز، وأعدت نويات من كل من أنواع الخلايا من خلال إجراء لفترات طويلة تنطوي على هضم الأنسجة. استغرقت العملية برمتها حوالي ثلاث ساعات لإكمال قبل الفورمالديهايد عبر ربط تم تنفيذها على نوى معزولة. في حين تجنب هذا الإجراء عبر ربط الألياف العضلية، مما يجعل الأنسجة العضلية أكثر صهر إلى التجانس كفاءة، وكان قادرا على إنتاج نوى ذات جودة عالية، والتخلف الوقت كبير من جمع الأنسجة إلى نوى عبر ربط يتكبد خطر الحمض النووي المتغير -البروتين التفاعل. في المقابل، أجرى معظم الدراسات عبر ربط مباشرة بعد العلاج التجريبي أو جمع الأنسجة من أجل الحفاظ على الوقت الحقيقي الحمض النووي بروتين ملزمة 12 . والعيب الثاني لعزل النوى قبل الربط المتبادل هو أنه يحول دون تطبيقات حساسة للوقت مثل جمع العينات البيولوجية التي تحدث عادة على فترات تتراوح بين 3 و 4 ساعات. دون ربط عبر النوى، والعزلة يحتاج إلى الشروع فورا بعد تشريح، في حين يمكن معالجة عينات عبر ربط معا بعد اكتمال بالطبع كامل الوقت، وبالتالي ضمان الاتساق التجريبي أكبر.
كما تم الإبلاغ عن بروتوكولات أخرى للعزل النوى من العضلات والهيكل العظمي أونكروسلينكد. وقد وصفت دراستان استخدام تنظير فائق التدرج لفصل نوى من الخلايا الليفية المتبقية والحطام الخلية 23 ، 24 . في حين أن السكروز أو الغروية التدرج النابض للضوء فعالة مع أنسجة العضلات أونكروسلينكد، كشفت تجاربنا أنه بعد التشابك، فشلت الطرد المركزي التدرج التدريجي لفصل نوى من الخلية دإبريس، عن، ال التعريف، التدرج.
ولذلك وضعنا إجراء لعزل نوى ذات جودة عالية باستخدام عبر ربط الماوس العضلات والهيكل العظمي الأنسجة. بدلا من التدرج الطرد المركزي، وضعنا طريقة الترشيح التسلسلي لفصل فعال نوى من الحطام. بعد أولتراسونيكاتيون، تم تطبيق عينات لونين بنجاح لدراسات رقاقة التي أظهرت نمط الساعة البيولوجية من البروتين BMAL1 ملزمة لمروجي الهدف. طريقة لدينا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمختلف الدراسات الميكانيكية من أنسجة العضلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف طريقة قوية حيث تم ربط الأنسجة العضلية الهيكلية عبر ربط لعزل نوى عالية الجودة. وقد أجريت الترشيح متسلسل من لفصل نواة فعالة من الحطام، والطاقة الصوتية بالموجات فوق الصوتية من محول على شكل طبق قص الكروماتين لتحليل رقاقة. وأظهرت النتائج ملاحق زمنية محددة في ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كارين إسر، نوبويا كويكي و نوهيون بارك للحصول على المشورة المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نيغمس (R01GM114424) ل S.-هي، ومؤسسة روبرت A. ويلش (أو-1731) و نيه / نيا (R01AG045828) إلى زك
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
