JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Complement Reseptör 1 Boyunca Polimorfizm Genotiplendirme için Yüksek Çözünürlükte Melting PCR: Alzheimer Hastalığı Gen Duyarlılık Değerlendirmesi için Yenilikçi Bir Araç

Published: July 18, 2017
doi:
10.3791/56012
, , , ,
1Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debré Hospital, 2Faculty of Medicine, LRN EA 4682,University of Reims Champagne-Ardenne, 3Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 4Faculty of Medicine, EA 3797,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Burada, çeşitli uygulamalarda kullanılmak üzere kompleman reseptör 1 (CR1) uzunluk polimorfizmlerini belirlemek için yenilikçi bir yöntem, özellikle Alzheimer hastalığı (AD) gibi hastalıklara duyarlılığın değerlendirilmesi ile açıklanmaktadır. Bu yöntem, AD patogenezinde CR1 izoformlarının rolünü daha iyi anlamak için yararlı olabilir.

Abstract

Doğal bağışıklık sisteminde anahtar rol oynayan bir transmembran glikoprotein olan kompleman reseptör 1 (CR1), birçok hücre tipinde, ancak özellikle kırmızı kan hücrelerinde (RBC) ifade edilir. C3b ve C4b kompleman bileşenleri için bir alıcı olarak, CR1 kompleman kaskadının aktivasyonunu düzenler ve bağışıklık komplekslerinin ve hücresel artıkların fagositozunu ve ayrıca Alzheimer hastalığında (AD) amiloid-beta (Aβ) peptidini teşvik eder. Birçok çalışma, AD ile ilişkili tek nükleotid polimorfizmleri (SNPler) yanı sıra CR1 geninde bir kopya sayısı varyasyonu (CNV) teyit etmiştir. Burada CR1 reseptörünün polimorfizminin uzunluğunu belirlemek için yenilikçi bir yöntem anlatılmaktadır. Reseptör, uzun homolog tekrarlar (LHR) -LHR-A, LHR-C ve LHR-D olarak adlandırılan üç alan ve n, 0 ila 3 arasında bir tamsayı olan bir n alanı, LHR-B'yi içerir. Tek bir çifti Spesifik primerlerin genetik materyali, LHR-B alanının bir birinci fragmanınıE varyant amplikon B) ve LHR-C alanının ikinci fragmanı (değişmez amplikon) içerir. Değişken amplikon B ve değişmez amplikon, sözü geçen primerlerin hibridizasyon alanlarının dışındaki beş nükleotideki farklılıkları gösterir. Değişken amplikonların B sayısı ve değişmez amplikonların sayıları niceliksel bir araç (yüksek çözünürlüklü erime (HRM) eğrileri) ile çıkarılır ve değişken amplifikatör B'nin değişmeyen amplikonun oranına CR1 uzunluğu polimorfizmine göre farklılık gösterir. Bu yöntem, kanonik fenotip yöntemine göre, taze materyal gerektirmeyen ve daha ucuz, daha hızlı ve daha geniş popülasyonlara uygulanabilir olduğu için birkaç avantaj sağlamaktadır. Dolayısıyla, bu yöntemin kullanılması, AD gibi hastalıkların patogenezinde CR1 izoformlarının rolünü daha iyi anlamak için faydalı olmalıdır.

Introduction

Demansın en yaygın nedeni olan AD, dünyadaki 30 milyon insanı etkiliyor ve önemli bir halk sağlığı sorunu 1 . Klinik olarak AD, ilerleyici bir özerklik kaybına neden olan nörobilişsel bozukluklarla karakterizedir 2 . AD, iki nöropatolojik özelliklerle, yani ekstraselüler amiloid birikimleriyle ve hücre içi nevrofibriller yumrularla karakterizedir 3 .

Geleneksel olarak, hastalığın başlangıç ​​yaşına göre AD iki şekilde sınıflandırılır. Birincisi, erken başlangıçlı AD (EOAD), başlangıçta 65 yaşından önce sıklıkla görülür; Bu form AD vakalarının% 5'inden daha azını oluşturmaktadır. Amiloid öncü protein ( APP) 4 , presenilin 1 ( PSEN1 ) 5 veya presenilin 2 ( PSEN2 ) 'de tam penetrant mutasyonlara neden olan, nadir görülen, otozomal dominant bir AD şeklidir.> 6 gen. İkincisi, hastalığın daha yaygın biçimi (AD vakalarının>% 90'ı), "yayık" geç başlangıçlı AD (LOAD) olarak adlandırılır ve çoğunlukla 65 yaş ve üzeri bireylerde görülür. Birden fazla genetik ve çevresel risk faktöründen kaynaklanır 7 . LOAD'da, apolipoprotein E ( APOE ) geninin 4 alleli, ana genetik risk faktörü 8 , 9'dur . Dahası, genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS) ile AD riskiyle bağlantılı olarak 20'den fazla gen lokusu tanımlanmıştır; bunlardan biri kompleman bileşeni (3b / 4b) reseptör 1 ( CR1 ) geni 10 , üzerinde Kromozom 1q32, kompleman ile ilişkili proteinlerin bir kümesinde bulunabilir. CR1 geni tamamlayıcı aktivite düzenleyicilerinin bir bileşenini oluşturan kompleman reseptör tipi 1 (CR1) proteinini kodlar.

CR1 (C3b / C4b reseptör, CD35), yaklaşık olarak transmembran bir glikoproteinEly 200 kDa 11 , C3b, C4b, C3bi, C1q, mannan bağlayıcı lektin (MBL) ve fikolin komplement proteinlerine 12 bağlanır. CR1'in biyolojik fonksiyonu, ifade edildiği hücre tiplerine göre değişir. İnsanlarda, dolaşımda olan toplam CR1% 90 kırmızı kan hücrelerinin (RBC) 13 bulunur. RBC yüzeyinde mevcut olan CR1, C3b veya opsiyonlu mikroorganizmalara veya bağışıklık komplekslerine bağlar ve dolaşımdan temizlenmesini kolaylaştırır. CR1'ye bağlı kompleksler RBC'ler karaciğere girdiğinde ve dalağın 11'i , 14'ünde dalgalandığında fagositlere gerçekten aktarılır. C3b ve C4b'nin çökelmesini sınırlandırarak, CR1 aşırı kompleman aktivasyonunu önleyebilir. Dolayısıyla CR1'in RBClerde ekspresyonu, serebral sinir sistemi gibi bağışıklık kompleks birikimine ve ortaya çıkan hastalıklara karşı dokuların korunmasında önemli bir unsur olarak düşünülür. RBC'lerde CR1 de bilinirPatojenik enfeksiyonlarda önemli bir rol oynar 15 , 16 . Buna ek olarak, doğuştan gelen bağışıklığın kilit bir oyuncusu olan CR1, kompleman kaskadının düzenlenmesinde ve bağışıklık komplekslerinin taşınmasında ve temizlenmesinde yer alır. CR1, C3b ve C4b parçalarını bağlayarak ve klasik ve alternatif dönüştürücüleri (C2a'nın C4b2a kompleksinden ayrılması ve C3b'nin C3bBb kompleksinden ayrışması) ayrıştırarak bu etkinliği uygular. Plazma serin proteaz faktörü I (FI) 'nın bir kofaktörü olan CR1, C4 faktörünün (cofactor activity (CA) olarak bilinen bir özellik olan FI tarafından C4b ve C3b klivajını arttırarak ve C3 amplifikasyon döngüsünü inhibe ederek klasik ve alternatif tamamlayıcı yolaklarını inhibe eder , Dolayısıyla ilave tamamlayıcı aktivasyonu önlemektedir. Rogers ve ark Ap peptidin bağlandığı olduğuna dair kanıt sağlamaktadır ve antikorlar 17 yokluğunda kompleman yolu aktive ve Ap peptit cl olduğunu göstermektedirCR1 etmek amacıyla kompleman-bağımlı yapışma ile dolaşımdan kulaklı eritrositlerin 18 olarak ifade edilmiştir.

CR1 polimorfizmlerinin üç tür sergiler: yapısal ya da uzunluk polimorfizmi, yoğunluk polimorfizmleri ve Knops kan grubu, 19 11 polimorfizmleri. Yapısal polimorfizm uzun homolog tekrarların (LHR) sayısındaki bir değişime bağlıdır ve bu nedenle dört izoformu tanımlar. Aslında, CR1 proteininin hücre dışı alanı kısa eşzamanlı tekrarlar (SCRs) veya komplement kontrol tekrarı (CCP) olarak adlandırılan bir dizi tekrarlayan birimden oluşur. Bu SCR'ler, CR1 kodlayan tamamlayıcı deoksiribonükleik asit (cDNA) 'dan kanıtlanmıştır. SCR'ler, LHR olarak bilinen yedi grup halinde düzenlenmiştir. CR1, yedi-SCR birimi 19 , 20'nin kopyalanmasından ortaya çıkan, LHR-A, -B, -C ve -D olarak adlandırılan dört LHR'ye yerleştirilir ;21 .

Frekans artan sırada, Western blot (WB) ile belirlenen bu CR1 izoformları CR1 * 1 (A / F) (jel elektroforezinde hızlı göç), CR1 * 2 (B / S) (jel elektroforezinde yavaş migrasyon), CR1 * 3 (C / F ') ve CR1 * 4 (D). CR1 * 3 (C / F ') ve CR1 * 4 (D (L / R)) iken, en sık rastlanan iki izoform CR1 * 1 (A / F) ve CR1 * 2 (B / S) sırasıyla dört ve beş LHR'den oluşur ) Sırasıyla 3 ve 6 LHR'den oluşur. 30 SCR'den oluşan en yaygın izoform (CR1 * 1), üç C4b bağlanma yeri (SCR 1-3, 8-10 ve 15-17) ve iki C3b bağlanma yeri (SCR 8-10 ve 15-17) , SCR 22-28 ise C1q, fikolinler ve MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25'i bağlar. Dolayısıyla, CR1 * 2, bir ilave C3b / C4b bağlama yeri içerirD CR1 * 1'e dönüştürülür. Şekil 1 , CR1'in dört farklı izoformunun yapılarını, nomenklatürlerini ve moleküler ağırlığını göstermektedir.

Yoğunluk polimorfizmi RBC'lerde CR1'in yapısal ekspresyon seviyesini temsil eden kararlı bir fenotipe karşılık gelir. Sağlıklı Kafkasya'lılarda, RBC başına CR1 molekül sayısının onluk bir faktöre kadar değişebileceği gösterildi (hücre başına 150 ila 1,200 molekül arasında değişen) 26 . Helgeson fenotip kırmızı kan hücreleri hücre 27, 28 başına daha düşük 150 moleküller olduğu gösterilmiştir çok düşük CR1 yoğunluğa sahiptir. RBC'lerdeki CR1 yoğunluğu, bir Hin dIII kısıtlama fragmanı uzunluk polimorfizmi (RFLP) ile korele olan, CR1 geninde bir otozomal kodominant bialelik sistem ile genetik olarak ilişkilidir 29 . CR1 geninin Intron 27'sinde tek noktalı bir mutasyon, ikinci kodlayıcı ekzonlar arasındaLHR-D'deki SCR, bu bölge 30'da bir polimorfik Hin dIII bölgesinin oluşmasına neden olur. 7.4 ve 6.9 kDa'lık genomik Hin dIII fragmanları, sırasıyla RBC'lerde yüksek (H alel) veya düşük (L alel) CR1 yoğunluğuyla ilişkili allelleri tanımlar. Ancak aynı ilişki Bazı Batı Afrika popülasyonları 31 32'sinde eritrosit ve Hin dili polimorfizmleri üzerinde CR1 yoğunluğu arasında bulunmuştur. CR1 yoğunluk düzenlenmesini kodlamayan bir Hin dIII polimorfizmine bağlayan mekanizma bilinmemektedir. Birkaç polimorfizm arasında SCR16'daki Q981H ve SCR28'deki P1786R'nin RBC'lerde 30 , 33'deki CR1 yoğunluğuyla bağlantılı olduğu rapor edilmiştir.

Uluslar arası terminolojiye göre Knops (KN) polimorfizmi Uluslararası Kan Transfüzyonu tarafından endekslenecek olan 22. kan grubu sistemidir. 9 antijenik speci içerirKN1 / KN2, KN3 / KN6 ve KN4 / KN7 ve üç izole edilmiş antijen, KN5, KN8, KN9 da dahil olmak üzere RBC'lerde CR1 tarafından ifade edilen özellikler. KN1, KN3, KN4 ve KN5 antijenleri, KN sisteminin yüksek frekanslı antijendir ( yani, genel nüfusun% 99'undan fazlasını ifade eder). Bununla birlikte, bu polimorfizmin AD'deki rolü belirlenmemiştir 13 .

Bu çalışmada açıklanan protokol, AD, sistemik lupus eritematozus ve sıtma gibi çeşitli hastalıklara yatkınlık gösteren CR1 uzunluğu polimorfizm genotiplerini belirlemek üzere tasarlanmıştır. CR1 uzunluğu polimorfizm belirleme metodumuz, CR1 izoformlarını ve LHR-B ve LHR-C arasındaki sekans farklılıklarını içeren LHR-Bs sayısını kullanır ( Şekil 2 ).

Protocol

İnsan kanlarının toplanması ve taşınması için protokol, bölgesel etik komitesince (CPP Est II) gözden geçirildi ve onaylandı ve protokol numarası 2011-A00594-37'dir. NOT: Aşağıdaki protokol insan kanının taşınmasını tanımlamaktadır. Biyolojik tehlikeli maddeler atarken lütfen kurumsal kurallara uyun. Laboratuar önlüğü ve eldiven gibi laboratuar güvenlik ekipmanları giyilmelidir. Protokolü açıklayan akış şeması Şekil 3'te gösterilmektedir. 1. Kan ve Vücut Sıvısı DNA Ekstraksiyonu 1.5 mL'lik bir tüpün tabanına proteinaz K'nın (15 μg / μL) 20 μL'ini pipetleyin. 1.5 mL tüpe 200 uL numune ekleyin. Tam kan, plazma, serum, ince beyaz tabaka ya da vücut sıvılarının 200 uL kadar kullanın veya 200 ul PBS içerisinde 5 x 10 6 lenfositler üzere. Numuneye 200 μL liziz tamponu ekleyin. Darbe-vorteksleme ile 15 s karıştırın. 56 ° C'de 10 dakika su banyosunda inkübe edin. Kapağın iç kısımlarındaki damlaları çıkarmak için 1.5 mL tübü kısaca santrifüjleyin. Numuneye 200 uL etanol (% 96-100) ilave edin ve 15 saniye için puls-vorteksleme ile tekrar karıştırın. Karıştırdıktan sonra, kapağın içerisindeki damlaları çıkarmak için 1.5 mL tübü kısaca santrifüjleyin. Karışımı adım 1.6'dan zar kolonuna dikkatlice uygulayın (2 mL toplama tüpünde). Jant ıslanmadan kapağı kapatın ve 6000 xg'de 1 dakika süreyle santrifüjleyin. Membran sütununu temiz bir 2 mL'lik toplama tüpüne yerleştirin ve filtratı içeren tüpü atın. Membran kolonunu dikkatle açın ve jant ıslanmadan 500 μL yıkama tamponu 1 ekleyin. Kapağı kapatın ve 6000 xg'de 1 dakika süreyle santrifüjleyin. Membran sütununu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve süzüntü içeren tüpü atın. Membran kolonunu dikkatli bir şekilde açın ve ıslatma yapmadan 500 uL yıkama tamponu 2 ekleyin.Diyelim. Kapağı kapatın ve 3 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin (20.000 xg). Membran sütununu yeni bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve süzüntü ile toplama tüpünü atın. 1 dakika 20,000 xg'de santrifüjleyin. Membran sütununu temiz bir 1.5 mL tüp içine yerleştirin ve filtratı içeren toplama tüpünü atın. Membran kolonunu dikkatle açın ve 200 uL damıtılmış su ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve daha sonra 1 dakika boyunca 6.000 xg'de santrifüjleyin. DNA konsantrasyon adımı belirlemeye devam edin veya DNA numunelerini -20 ° C'de dondurun 2. DNA Konsantrasyonunun Belirlenmesi NOT: Bakınız Şekil 4 . Bir spektrofotometre üzerinde DNA modu seçmek için 1'e basın. Sol ve sağ okları kullanarak 5 mm'lik bir yol uzunluğu seçin. Sol ve sağ okları kullanarak bir seyreltme faktörü 1 seçin. Kullanarak birimi (μg / mL) seçin.E sol ve sağ oklar. Sol ve sağ okları kullanarak faktör 50'yi seçin. Tamam düğmesine basın. Damıtılmış suyun 10 μL'ini küvete pipetleyin. Küveti spektrofotometrenin içine koyun. OA /% 100 T düğmesine basın. DNA örneğinin 10 uL'ini (damıtılmış suda 1/4 seyreltme) pipetle küvete pipetleyin. Küveti spektrofotometrenin içine koyun. Yeşil düğmeye basın (okuma / başlatma). Konsantrasyona dikkat edin. DNA örneğini -20 ° C'de dondurun. 3. HRM-PCR Protokolü DNA örneklerini çözdüler. 10 ng / ml'lik bir konsantrasyona ayarlamak için 1.5 mL'lik tüplerdeki DNA örneklerini su ile inceltin NOT: Seyreltilmiş DNA'nın toplam hacmi 2 μL ila 10 μL arasında olmalıdır. Astar solüsyonlarını çözdüler. 6 mL'lik konsantrasyona ayarlamak için primer solüsyonlarını 1.5 mL'lik tüplerde seyreltin. NOT: Primer dizileri ve reaksiyon koşulları, TYetenekli 1. Tablo 1: Yüksek çözünürlüklü ergime analizinde kullanılan primerler ve parametreler. HRM-PCR kiti çözeltilerini çözün ve tüm içeriğin geri kazanılmasını sağlamak için vorteksleme ile dikkatlice karıştırın. Kısaca açmadan önce bir mikrosantrfuj DNA bağlanma boya, MgCI2, ve su ile enzimatik karışımı içeren üç şişe dönerler. Oda sıcaklığında saklayın. 1.5 mL'lik bir tüpte oda sıcaklığında, aşağıda listelenen sıraya göre aşağıdaki bileşenleri ekleyerek bir 20 μL reaksiyon için PCR karışımı hazırlayın: 10 μL DNA bağlama boyası ile enzimatik karışım; 25 mM MgCl2 2 uL; 1 uL primer 1, 6 uM (nihai konsantrasyon: 300 nM); 1 uL primer 2, 6 uM (nihai konsantrasyon: 300nM); ve 5 uL su. NOT: PCR karışımını birden fazla tepki için hazırlamak için, çalıştırılacak tepkime sayısıyla birlikte bir tepkime sayısıyla çarpın. Harmanlayarak dikkatlice karıştırın. Pipet Yukarıda hazırlanan 19 μL PCR karışımı, beyaz bir çoklu plakanın her kuyucuğuna pipetleyin. Adım 3.1'de hazırlanan konsantrasyona göre ayarlanmış DNA şablonu 1 μL ekleyin. NOT: Kontrol reaksiyonları için, numuneler ile daima bir negatif kontrol çalıştırın. Negatif bir kontrol hazırlamak için şablon DNA'yı su ile değiştirin. Beyaz çoklu plakayı sızdırmazlık folyosu ile kapatın. Santrifüjde beyaz çok oyuklu plaka koyun ve uygun bir karşı ağırlık (diğer bir deyişle, diğer bir çok-yuvalı plaka) ile denge. Uygun adaptörler ile çoklu plakalar için bir rotor içeren standart bir salınım kovası santrifüjünde 1 dakika 1,500 xg'de santrifüjleyin. HRM-PCR cihazına beyaz çoklu plakayı yerleştirin. Aşağıdaki PCR koşullarıyla HRM-PCR programını başlatın: Denatürasyon: 95 ° C'de 10 dakika; 1 döngü. Amplifikasyon: 10 saniye boyunca 95 ° C, 15 saniye boyunca 62 ° C ve 20 saniye boyunca 72 ° C; 47 döngü. Erime eğrisi: 95 ° C; Rampa hızı: 0,02 ° C / s; ° C başına 25 satın alma; 1 döngü. Soğutma: 30 saniye süreyle 40 ° C; Rampa hızı 2,2 ° C / s; 1 döngü. 4. CR1 Uzunluk Polimorfizmini Belirlemek İçin İKY Analizi NOT: Açıklanan metodoloji ( Şekil 5 ) diğer yazılım paketleri de kullanılabilecek olsa da, yazılımımıza özeldir (Bkz . Malzeme Tablosu ). CR1 uzunluğu polimorfizm tarama analizi yapmak için bir gen tarama yazılımı açın. Amplifikasyon programını ve erime eğrisi programını içeren deneyi açın. Modül çubuğunda Örnek düzenleyici'yi tıklayın ve ardından SKonserve iş akışı . Örneklerin özelliklerini tanımlayın ( yani adı, bilinmeyen veya negatif kontrol). Modül çubuğunda Analiz'i tıklayın. Yeni Analiz Oluştur listesinde Gen Taraması'nı seçin . Eritme eğrilerini normalleştirmek için Normalleştirme sekmesini tıklayın. Erime eğrilerinin sıcaklık eksenini (x ekseni) sıfırlamak için Sıcaklık kayması sekmesini tıklayın. NOT: Alt grafik hem normalize hem de sıcaklık kayması olan erime eğrilerini göstermektedir. Sonuçları analiz etmek ve gruplamayı belirlemek için Hesapla butonuna tıklayın. Normalleştirilmiş ve Değiştirilmiş Erime Eğrileri ile Normalleştirilmiş ve Sıcaklık Değiştirilmiş Fark Çizimini görüntülemek için çizelgeler alanında Fark çizgisi sekmesini tıklayın.

Representative Results

Şekil 6 A , CR1 uzunluk polimorfizminin fenotiplemesini WB ile gösterir. Şekil 6 B ve C , İKM-PCR analizi sırasında elde edilen ve CR1 uzunluk polimorfizminin belirlenmesini sağlayan eğrileri göstermektedir. Farklı CR1 izoformlarına sahip kişilerin genomik DNA'larından PCR ile türetilen amplikonların yüksek çözünürlüklü erimesinden sonra yazılımı kullanarak füzyon eğrilerinin analizleri, denekleri allotipik CR1 ekspresyon fenotiplerine göre ayırt eden eğriler üretir. Şekil 6 B , "Normalleştirilmiş ve Değiştirilmiş Erime Eğrileri" adı verilen ilk tanıtım modunu görüntülerken Şekil 6 C , "Normalleştirilmiş ve Sıcaklık Değiştirilmiş Fark Çizimi" olarak adlandırılan ikinci bir sunum modunu görüntüler. <p class="jove_content" fo:keEp-together.within-page = "1"> Eğrilerin profilleri, Şekil 6 A'da gösterilen fenotipleri temsil eden gruplara göre dağıtılır: (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Ve (CR1 * 2, CR1 * 4). Bu, bu yeni moleküler biyoloji yöntemini kullanarak CR1 uzunluk polimorfizminin genotiplendirmesini sağlar. Şekil 1: Kompleman reseptör 1 proteininin yapısı ve polimorfizmlerinin şematik gösterimi. Her kısa konsensüs tekrarlaması (SCR) veya komplement kontrol proteini (ÇKP) bir daire ile gösterilir. SCR'ler, LHR'ler olarak adlandırılan, tekrar eden ve daha üst düzey bir yapıya gruplandırılmıştır. Hücre dışı bölgeden hücre zarıya kadar LHR'ler: LHR-A, -B, -C, -D ve -S (ek veya ilave LHR) 'dir. En yaygın CR1 izoformunda(SCR 1-3, yeşil daireler), C4b / çürüme hızlandırıcı aktivite (DAA) bağlanma bölgesi, LHR-A'da (CR1 * 1) bulunur, C3b / C4b / LHR-B'nin (SCR 8-10, kırmızı daireler) ve LHR-C'nin (SCR 15-17, mor halkalar) N-terminal SCR'leri ve C1q / MBL ve fiklin için bağlama bölgesi LHR-D'de (SCR'ler 22-28, mavi daireler). Homolog yapılar aynı renktedir. CR1 * 2 (S) izoformu ilave bir LHR (LHR-S) sunar ve bu nedenle ilave bir C3b / C4b bağlanma yeri içerir. KDa, kilodalton. NRC, indirgenmemiş koşullar. RC, azalmış koşullar. TM, transmembran etki alanı. Bu rakam Brouwers ve ark. 36 Nature Publishing Group'un izniyle. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src= "/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" /> Şekil 2 : HRM-PCR ile elde edilen dizilim amplikon pozisyonlarına sahip CR1 izoform yapısının şematik gösterimi. Her kutu bir SCR'yi temsil eder. SCR'ler LHR'lere ayrılır: LHR-A, -B, -C ve -D. Homolog yapılar aynı renktedir. CR1 * 2 ve CR1 * 4 izoformları ilave LHR'ler (LHR-B) sunar ve bu nedenle ek bir amplikon alanı (kırmızı olan amplikon B) içerir. CR1 * 3, LHR-B'den yoksundur ve daha az amplikon alanı (amplikon B içermez) içerir. Amfikon B (196 bp) ve değişmez amplikon (197 bp) arasındaki nükleotid farklılıkları sırasıyla kırmızı ve mavi olarak gösterilmiştir. Oran farklılıkları: Her bir CR1 izoformu arasındaki (amplikon B, kırmızı / değişmez amplikon, mavi), HRM-PCR ile genotiplendirme yaparak belirlenir. CN3 ve CN3re primer sekansları altı çizilir. TM, transmembran etki alanı. CYT, sitoplazmik kuyruk.Pg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 3: İnsan kan örneklerinden CR1 uzunluk polimorfizminin genotiplendirilmesi protokolünün akış şeması. Bir insan DNA örneği toplayın. Bir DNA kan örneği elde etmek için DNA'yı çıkarın. DNA konsantrasyonunu belirleyin ve 10 ng / μL'de DNA konsantrasyonunu elde etmek için seyreltin. CR1 uzunluğu polimorfizm genotipi elde etmek için HRM-PCR kullanın. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 4 : Spektrofotometrenin ekran görüntüleri DNA konsantrasyonunu belirlemek için. Spektrofotometre üzerinde DNA modu seçmek için 1 ( A ) tuşuna basın. Sağ ve sol ok (C) bir 5 mm yol uzunluğu (B) seçin. Sol ve sağ okları ( C ) kullanarak birimi (μg / mL) ( D ) seçin. Sol ve sağ okları ( C ) kullanarak seyreltme faktörü 1'i ( E ) seçin. Sol ve sağ okları kullanarak bir faktör 50 ( F ) seçin. Tamam tuşuna basın ( G ). Damıtılmış suyun 10 μL'ini küvete pipetleyin. Küveti spektrofotometreye koyun ( H ). OA /% 100 T düğmesine ( I ) basınız. Küvete DNA örneğinin 10 μL'sini (damıtılmış suda 1/4 seyreltme) pipetleyin. Küveti spektrofotometreye koyun ( K ). Yeşil düğmeye (okuma / başlatma) ( L ) basın. Konsantrasyona ( M ) dikkat edin.Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 5: Protokolün 4. adımında kullanılan yazılımın grafik arayüzünün ekran görüntüleri. ( A ) Gen tarama yazılımını açın. ( B ) Amplifikasyon programı ve erime eğrisi programı. ( C ) Modül çubuğundaki Örnek editörüne tıklayın. (D) seç tarama. ( E ) Örneklerin özelliklerini tanımlayın. ( F ) Modül çubuğunda Analiz'i tıklayın. ( G ) Eritme eğrilerini normalleştirmek için Normalleştirme sekmesini tıklayın. ( H ) Her ikisi de erime eğrilerini göstermek için Sıcaklık kayması sekmesine tıklayınNormalize ve sıcaklık kayması. ( I ) Sonuçları analiz etmek ve gruplamayı belirlemek için Hesapla butonuna tıklayın. ( J ) Normalleştirme ve Kaydırılan Erime Eğrilerini ve Normalleştirilmiş ve Sıcaklık Değiştirilmiş Fark Çizimini görüntülemek için Fark çizelgesi sekmesine tıklayın. ( K ) Örneklerin CR1 uzunluk genotiplerine göre renklendirilmiş gruplandırılması. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 6: WB'de gözlenen CR1 uzunluk polimorfizmlerinin fenotiplemesi ve HRM-PCR ile elde edilen karşılık gelen profil eğrileri. ( A ) W1 kullanılarak CR1 uzunluk polimorfizmlerinin fenotipi. ( B </stRong>) ve ( C ) HRM-PCR analizi kullanılarak CR1 uzunluk polimorfizmlerinin genotiplendirilmesi. Farklı CR1 izoformları gösteren kişilerin genomik DNA'larından elde edilen PCR amplikonlarının HRM eğrisi analizi spesifik eğri profillerinin tanımlanmasına yol açtı: (CR1 * 3, CR1 * 1) (mor); (CR1 * 1, CR1 * 2) (mavi); CR1 * 1 (yeşil); CR1 * 2 (kırmızı); Ve (CR1 * 2, CR1 * 4) (gri). Bunlar, CR1 uzunluğu polimorfizm allellerine karşılık gelir. İki sunum modu – "Normalize Edilmiş ve Değiştirilmiş Erime Eğrileri" (B) ve "Normalize ve Temp-Kaydırılan Fark Çizimi" (C) ile gösterildiği gibi – eğri profilleri, (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Ve (CR1 * 2, CR1 * 4) grupları. Bu rakam Mahmudi ve ark. Elsevier'den izin alınarak 38 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada, CR1 uzunluk polimorfizmlerini incelemek için yaygın olarak erişilebilen bir metodolojiyi açıklamaktayız. Amplifikasyon veya segmental hibridizasyon için moleküler biyoloji teknikleri, tüm bireylerde CR1 uzunluğu polimorfizmlerinin belirlenmesine olanak tanıyan tatmin edici sonuçlar vermemişti. Bunun nedeni, CR1 geninin tekrarlayan yapısı ( yani CR1'in oldukça tekrarlayan SCR'leri) olmasıdır. Burada açıklanan moleküler biyoloji yöntemi, CR1 molekülündeki LHR-B'nin niceliksel dağılımını kullanmaktadır. CR1 molekülü, Şekil 2'de tarif edildiği ve gösterildiği gibi, n'nin 0 ila 3 arasında bir sayı ve sadece bir LHR-C alanı olan n LHR-B alanlarını içerir. Kantitatif alan B tespiti, bir ek veya eksik alan B'yi mükemmel şekilde ayırt etmeyi mümkün kılar.

Çıkarılan genetik materyalden, LHR-B'den bir ilk DNA parçası, tek bir çift spesifik primer kullanılarak PCR ile amplifiye edilir, temsil edilenLHR-B'nin "varyant amplikon B" olarak adlandırılan karakteristik bir varyantı olması. "Değişmez amplifikon" olarak adlandırılan ve LHR-C'ye ait olan ikinci bir DNA fragmanı da büyütülür. Bu ikinci DNA parçası, LHR-C'nin bir fragmanıdır, ancak LHR-A veya -D'nin bir diğer değişmez parçası da kullanılabilir.

İki DNA fragmanı, varyant amplifikon B ve değişmez amplikon aynı primerlerle çoğaltılır ve nükleotid sekanslarında beş farklılık gösterir. Bu özellik, bir sonraki adımda, bu amaca yönelik olarak adapte edilmiş nicel bir moleküler biyoloji aracı HRM kullanarak varyant amplikon B sayısını ve değişmeyen amplikon sayısını belirlemeyi mümkün kılar. Amplikon B ve değişmeyen amplifikon (oran: amplikon B / değişmez amplikon) sayısı arasındaki oran CR1 molekülünün uzunluğuna göre değişir. Gerçekten, CR1 * 4, 1 değişmez amplifikona 3 amplicon B birimi, CR1 * 2, 1 değişmez amplikon için 2 amplicon B birimi, CR1 * 1, 1 değişmez amplifikona 1 amplikon B ve CR1 * 3, 1 değişmez amplikona 0 amplikon B birimi görüntüler ( Şekil 2 ). Dolayısıyla, bu HRM-PCR yöntemi, CR1 uzunluğu polimorfizminin genotiplendirilmesini sağlar.

Bununla birlikte, bu tekniğin çalışmasının başında elde edilen eğrilerin referans profiline göre CR1 genotiplendirmesini gerçekleştirebilmek için, CR1 fenotipleri zaten bilinen ( yani daha önce WB tarafından kurulmuş) referans cisimlerin kullanılmasını gerektirir HRM-PCR ile. İki tür gösterim, yani "Normalize Edilmiş ve Dönüş Edilen Erime Eğrileri" ve "Normalize Edilmiş ve Temp Değiştirilmiş Fark Çizimi" mevcuttur. WB ( Şekil 6 ) tarafından elde edilen CR1 uzunluk polimorfizm fenotiplendirmesine göre renkli ayrı eğri profil grupları sergilerler. "Normalize Edilmiş ve Değiştirilmiş Erime Eğrileri" adımından, yöntemimiz,Renkle gruplandırılmış CR1'in izoformlarına karşılık gelen eğrilerin farklı grupları. Bununla birlikte, farklı bir matematiksel gösterime karşılık gelen "Normalize Edilmiş ve Temp Değiştirilmiş Fark Çizimi", farklı eğri gruplarının daha kolay görselleştirilmesine olanak tanır. Üreticinin yazılımı rutin olarak bu çalışmada kullanılmış olmasına rağmen, eğri analizi için bir veri çıkarma programı olarak diğer yazılımlar (uANALYSE gibi) kullanılabilir.

Bugüne kadar, WB analiz tekniği, protein seviyesinde farklı CR1 uzunluk polimorfizmlerinin tanımlanmasını sağlayan orijinal tekniktir. Bununla birlikte, bu tekniğin bir takım dezavantajları vardır. Özellikle WB'nin protein analizi, sadece hücre membranlarının çıkarılmasından sonra yapılabilir. Sonuç olarak, karmaşık ve çok zaman alıcıdır. Ayrıca, bu teknik, yararlı res elde etmek için prosedürün başlangıcında uygun koşullarda yeni bir kan örneği alınmasını gerektirirka bul etmez. Tersine, DNA üzerinde yapılan HRM-PCR, uzun süreli saklamadan sonra bile kuru kan lekelerinin veya örneklerinin kullanılmasını mümkün kılar. HMR-PCR özel bir DNA eriyik aleti gerektirir, ya özel bir enstrüman ya da HRM yazılımı ile bir HMR kapasiteli thermocycler. SNP tespiti birkaç faktöre bağlıdır: i) Büyük PCR fragmanlarına dahil edilen SNP'ler, küçük PCR fragmanlarında aynı SNP'lerden daha tespit etmek daha zordur; ii) sınıfları III ve IV'e ait SNP sınıfları l'dekiler ve II 34 daha tespit etmek daha zordur; Ve iii) en yakın komşu baz simetrisi ile çevrelenen SNP'ler ( örneğin 5'-G (G / C) C-3 '), HMR platformunun çözünürlük gücüne bakılmaksızın ergime ile sınıflandırılamaz. Tahlilin geçerliliğini değerlendirmek için uMELT yazılımı 35 ile ilgili SNP'yi içeren tahmini PCR fragmanlarını test etmek faydalı olabilir. Son olarak, HMR-PCR, analog bir yöntemdir; erime eğrileri bahisinin benzerliğiBir referans ve bir şablon, şablon dizisinin referansla aynı olduğunu ima etmemektedir, çünkü şablon dizisi referansdan farklı ancak termodinamik olarak eşdeğer olabilir. Bununla birlikte, bu kısıtlamalar, burada tarif edilen ve 5 nükleotid sekans açısından farklı amplikonların bir karışımının eritilmesine dayanan yöntem için geçerli değildir.

Buna ek olarak, burada anlatılan, İKY analizine dayanan teknik pek çok avantaja sahiptir. İlk olarak, CR1 uzunluk polimorfizmleri daha hızlı belirlenir, çünkü sonuçlar, genetik materyalin ekstraksiyonu gerçekleştirildikten yaklaşık 2 saat sonra elde edilir. Tersine, WB protein analizine dayanan geleneksel biyokimyasal teknikler, nispeten uzun olan adımları gerektirir: bir hücre zar özünün bir akrilamid jel üzerinden elektroforezi, proteinlerin bir nitroselüloz ya da poliviniliden florür (PVDF) zarına aktarılması için bir adım ve IzoformlarıCR1 molekülünü immünokemilüminesansla izole eder. İkincisi, İKY-PCR tekniği, özellikle Alzheimer hastalığı gibi patolojilerin gelişimine duyarlılıklarını belirlemek için birçok kişiye ( örn. Largeskale) uygulanması muhtemel bir yöntem için özellikle çok pahalı olmayan bir avantaja sahiptir; Lupus veya sıtma.

Yakın zamanda, biz ve diğerleri, bir ilave C3b / C4b bağlanma yeri içeren CR1 * 2 izoformunun AD 36 , 37 , 38 ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Daha önce yayınlanan çalışmamızda, gen ve protein düzeyindeki CR1 uzunluk polimorfizmleri 38. deneklerin% 98.9'unda tutarlıydı. HRM-PCR ile elde edilen uzunluk polimorfizmlerini WB ile elde edilenler ile karşılaştırırken elde edilen uyuşmayan sonuçlar, HRM (gen) tarafından belirlenen fakat (CR1 * 1, CR1 * 2) genotip profiline sahip kişilerleWB (protein) 'e göre eritrosit yüzeyinde sadece CR1 * 1 izoformuna basıldığında. Çalışmamızda, WB daha uzun bir maruz kalma süresi ile uygulandığında CR1 * 2 izoform ekspresyonunun (sessiz bir alleli taşıyan bireylerin) yokluğu tekrarlanabilir ve açıklanan sessiz bir CR1 alelinin (CR1 * 2) varlığı ile açıklanabilir Helgeson tarafından literatürde 39 . Bununla birlikte, bu hipotezi desteklemek için daha büyük popülasyonlar hakkında daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Özel SNP'lerin (yalnızca küçük bir aile grubunda ya da tek bir bireyde meydana gelen SNP'lerin) referans fenotip tayini (WB) kullanılarak deşifre edilmesi gereken farklı eğri profillerine yol açtı, ancak bunu önlemek için kanonik profil ile karıştırılamayacağı belirtilmelidir CR1 uzunluğu polimorfizm genotipinin yanlış yorumlanması.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Plateforme Régionale de Biologie Innovante, İmmünoloji Departmanı personeli ve protokolün optimize edilmesine ve onaylanmasına katkıda bulunan İç Hastalıkları ve Yaşlılık Bilim Dalı'nın çalışanlarına teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Reims Üniversitesi Hastaneleri tarafından finanse edildi (hibe numarası AOL11UF9156). Yazı işleri yardımı için ayrıca Fiona Ecarnot'a (EA3920, Üniversite Hastanesi Besancon, Fransa) teşekkür ediyoruz.

Materials

Lab coat protection
SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
TipOne 10µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
TipOne 1-100µL bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
ART 1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 51306 DNA Extraction
Buffer AL Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19075 Lysis buffer
QIAamp Mini Spin Column Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 1011706 DNA binding
Buffer AW1 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19081 Wash buffer
Buffer AW2 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19072 Wash buffer
Biowave DNA spectrophotometer Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England 80-3004-70 DNA concentration 
Mikro 200 centrifuge Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany 0002020-02-00 centrifugation
Eppendorf Combitips advanced, 1.0 mL, Eppendorf Biopur Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030089642 distribution
Multipette E3 Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4987000010 distribution
Light Cycler 480 multiwell plate 96, white Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04729692001 reaction place
Light Cycler 480 sealing foil Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04429757001 coverage
Heraeus Megafuge 11R centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 75004412 centrifugation
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 05015278001 high resolution melting polymerase chain reaction
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04909631001 reaction reagents
light cycler 480 SW 1.5.1 software Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis
CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent
CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer’s Disease International. , (2015).
  2. McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer’s disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer’s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer’s disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
  3. Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T. Neuropathological alterations in Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006189 (2011).
  4. Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer’s disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
  5. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
  6. Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer’s disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
  7. Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
  8. Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
  9. Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer’s disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
  10. Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer’s disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
  11. Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
  12. Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
  13. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  14. Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
  15. Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
  16. Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
  17. Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
  18. Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
  19. Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
  20. Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
  21. Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
  22. Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
  23. Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
  24. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  25. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  26. Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
  27. Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
  28. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
  29. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
  30. Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
  31. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
  32. Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
  33. Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
  34. Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
  35. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  36. Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
  37. Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer’s disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
  38. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer’s disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
  39. Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).

Tags

Complement Receptor 1 Length PolymorphismHigh-resolution Melting PCRAlzheimer’s DiseaseGenotypingNeuroscienceDNA ExtractionProteinase KLysis BufferEthanolMembrane Column

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kisserli, A., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Duret, V., Mahmoudi, R. High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer’s Disease Gene Susceptibility Assessment. J. Vis. Exp. (125), e56012, doi:10.3791/56012 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image