PCR di fusione ad alta risoluzione per il recettore del complemento 1 lunghezza di polimorfismo Genotipizzazione: uno strumento innovativo per la malattia di Alzheimer Valutazione sulla suscettibilità dei geni

Qui descriviamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare polimorfismi di lunghezza CR1. Le tecniche di biologia molecolare per l'amplificazione o l'ibridazione segmentale non hanno mai potuto dare risultati soddisfacenti che consentano la determinazione dei polimorfismi di lunghezza CR1 in tutti gli individui. Ciò è dovuto alla struttura ripetitiva del gene CR1 ( cioè i SCRs di CR1 altamente ripetitivi). Il metodo di biologia molecolare qui descritto sfrutta la distribuzione quantitativa di LHR-B nella molecola CR1. La molecola CR1 comprende n domini LHR-B, dove n è un numero compreso tra 0 e 3 e solo un dominio LHR-C, come descritto e illustrato nella figura 2 . Il rilevamento quantitativo di dominio B consente di discriminare perfettamente un dominio aggiuntivo o mancante B.

Dal materiale genetico estratto, un primo frammento di DNA di LHR-B viene amplificato mediante PCR usando un singolo paio di primer specifici, rappresentanoUna variante caratteristica di LHR-B chiamata "amplicon variante B." Viene inoltre amplificato un secondo frammento di DNA, chiamato "amplicon invariante" e appartenente a LHR-C. Questo secondo frammento di DNA è un frammento di LHR-C, ma un altro frammento invariante di LHR-A o -D potrebbe anche essere utilizzato.

I due frammenti di DNA, l'amplicone variante B e l'amplicone invariante, sono amplificati dagli stessi primers e presentano cinque differenze nelle sequenze di nucleotidi. Questa caratteristica rende possibile nella fase successiva determinare il numero dell'amplicone variante B e il numero di ampliconi invarianti utilizzando uno strumento quantitativo di biologia molecolare, HRM, che è stato adattato a questo scopo. Il rapporto tra il numero di amplicon B e l'amplicone invariante (rapporto: amplicon B / amplicon invariante) varia in funzione della lunghezza della molecola CR1. Infatti, CR1 * 4 visualizza 3 unità di amplicon B a 1 amplicon invariante, CR1 * 2 visualizza 2 unità di amplicon B a 1 amplicone invariante, CR1 * 1 visualizza 1 amplicone B ad 1 amplicone invariante e CR1 * 3 visualizza 0 unità di amplicon B a 1 amplicon invariante ( Figura 2 ). Così, questo metodo HRM-PCR consente la genotipizzazione del polimorfismo della lunghezza CR1.

Tuttavia, all'inizio dello studio, questa tecnica richiede l'uso di soggetti di riferimento i cui fenotipi CR1 sono già noti ( vale a dire precedentemente stabiliti da WB) per poter stabilire la genotipizzazione di CR1 in base al profilo di riferimento delle curve ottenute Da HRM-PCR. Sono disponibili due tipi di rappresentazione, vale a dire "Curve di fusione normalizzate e spostate" e "Differenze di livello normalizzate e temporanee". Esse presentano gruppi distinti di profili di curva colorati secondo la fenotipizzazione polimorfica di lunghezza CR1 ottenuta da WB ( Figura 6 ). Dalla "step Normalized and Shifted Melting Curves", il nostro metodo consente di discriminare il thGruppi distinti di curve corrispondenti alle isoforme di CR1, raggruppate per colore. Tuttavia, il "Differenziale Plot Normalizzato e TEMP", che corrisponde ad una diversa rappresentazione matematica, consente di visualizzare più facilmente i distinti gruppi di curve. Sebbene il software del produttore venisse utilizzato in modo rutile in questo studio, altri software (ad esempio uANALYSE) potrebbero essere utilizzati come programma di estrazione dati per l'analisi della curva.

Ad oggi la tecnica di analisi WB è la tecnica originale che consente di identificare i differenti polimorfismi della lunghezza CR1 a livello della proteina. Tuttavia, questa tecnica presenta numerosi svantaggi. In particolare, l'analisi proteica da WB può essere fatta solo dopo l'estrazione delle membrane cellulari. Di conseguenza, è complesso e richiede molto tempo. Inoltre, questa tecnica richiede l'ottenimento di un campione di sangue fresco in condizioni appropriate all'inizio della procedura per ottenere rese utiliULT. Al contrario, HRM-PCR eseguita sul DNA rende possibile l'utilizzo di macchie o campioni di sangue seccamente secche dopo l'immagazzinamento a lungo termine. HMR-PCR richiede uno strumento specialistico di fusione di DNA, uno strumento dedicato o un termociclatore di capacità HMR con software HRM. La rilevazione di SNP dipende da diversi fattori: i) i SNP inclusi in grandi frammenti di PCR sono più difficili da rilevare che gli stessi SNP in piccoli frammenti di PCR; Ii) le SNP appartenenti a classi III e IV sono più difficili da rilevare rispetto a quelle delle classi I e II ³⁴ ; E iii) le SNP che sono affiancate dalla simmetria di base vicina-vicina ( ad esempio, 5'-G (G / C) C-3 ') non possono essere ordinate mediante fusione, indipendentemente dalla potenza di risoluzione della piattaforma HMR. Può essere utile testare i frammenti di PCR previsti che contengono il SNP di interesse con il software uMELT ³⁵ per valutare la validità del saggio. Infine, HMR-PCR è un metodo analogico, il che significa che la somiglianza delle curve di fusione scommetteUn riferimento e un modello non implicano necessariamente che la sequenza di modelli sia identica al riferimento, in quanto la sequenza di modelli può essere diversa dal riferimento ma equivalente termodinamicamente. Tuttavia, queste limitazioni non si applicano al metodo descritto qui, basato sulla fusione di un mix di ampliconi che si differenziano in termini di 5 sequenze di nucleotidi.

Inoltre, la tecnica descritta qui, basata sull'analisi della HRM, ha molti vantaggi. In primo luogo, i polimorfismi della lunghezza CR1 sono determinati più rapidamente, poiché i risultati sono ottenuti in circa 2 h una volta estratto l'estrazione del materiale genetico. Al contrario, le tecniche biochimiche tradizionali basate sull'analisi della proteina WB richiedono passi relativamente lunghi: l'elettroforesi degli estratti della membrana cellulare attraverso un gel di acrilamide, un passaggio per trasferire le proteine ​​a una membrana nitrocellulosa o fluoruro di polivinilidene (PVDF) e un passaggio per identificare Isoforme delMolecola CR1 mediante immunochemiluminescenza. In secondo luogo, la tecnica HRM-PCR ha anche il vantaggio di non essere troppo costoso, particolarmente importante per un metodo che potrebbe essere applicato a molti individui ( cioè largescale) per determinare la loro suscettibilità allo sviluppo di patologie come la malattia di Alzheimer, Lupus o malaria.

Recentemente, noi e altri abbiamo dimostrato che l'isoforma CR1 * 2, che contiene un ulteriore sito di legame C3b / C4b, è stata associata con AD ^{36 , 37 , 38} . Nel nostro studio precedentemente pubblicato, i polimorfismi di lunghezza CR1 a livello del gene e della proteina erano coerenti nel 98,9% dei soggetti ³⁸ . I risultati discordanti ottenuti quando si confrontano i polimorfismi di lunghezza ottenuti da HRM-PCR con quelli ottenuti da WB corrispondevano a soggetti con un profilo genotipico (CR1 * 1, CR1 * 2) determinato da HRM (gene) ma exPremendo solo la isoform CR1 * 1 alla superficie dell'eritromicina secondo WB (proteina). Nel nostro studio, la mancanza di espressione isoformica CR1 * 2 (individui con un allele silenzioso) è stata riproducibile quando il WB è stato eseguito con un tempo di esposizione più lungo e potrebbe essere spiegato dall'esistenza di un silente CR1 allele (CR1 * 2), descritto In letteratura da Helgeson ³⁹ . Tuttavia, ulteriori studi su popolazioni più grandi sono necessarie per sostenere questa ipotesi.

Va notato che SNP privati ​​(SNPs che si verificano solo in un piccolo gruppo familiare o persino in un singolo individuo) hanno portato a profili distinti di curva che devono essere decifrati usando la determinazione del fenotipo di riferimento (WB) ma che non può essere confuso con il profilo canonico per evitare Qualsiasi errata interpretazione del genotipo del polimorfismo di lunghezza CR1.