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Genetics

Hochauflösende Schmelz-PCR für Komplement-Rezeptor 1 Länge Polymorphismus Genotypisierung: Ein innovatives Werkzeug für die Alzheimer-Krankheit Gen-Anfälligkeits-Assessment

Published: July 18, 2017
doi:
10.3791/56012
, , , ,
1Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debré Hospital, 2Faculty of Medicine, LRN EA 4682,University of Reims Champagne-Ardenne, 3Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 4Faculty of Medicine, EA 3797,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Hier beschreiben wir eine innovative Methode zur Bestimmung von Komplementrezeptor 1 (CR1) Länge Polymorphismen zur Verwendung in mehreren Anwendungen, insbesondere die Beurteilung der Anfälligkeit für Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit (AD). Diese Methode könnte nützlich sein, um besser zu verstehen, die Rolle der CR1-Isoformen in der Pathogenese von AD.

Abstract

Complement Rezeptor 1 (CR1), ein Transmembran-Glykoprotein, das eine Schlüsselrolle im angeborenen Immunsystem spielt, wird auf vielen Zelltypen, aber vor allem bei roten Blutkörperchen (RBCs) ausgedrückt. Als Rezeptor für die Komplementkomponenten C3b und C4b reguliert CR1 die Aktivierung der Komplementkaskade und fördert die Phagozytose von Immunkomplexen und Zelltrümmern sowie das Amyloid-beta (Aβ) -Peptid bei der Alzheimer-Krankheit (AD). Mehrere Studien haben AD-assoziierte einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) sowie eine Kopienzahlvariation (CNV) im CR1- Gen bestätigt. Hier beschreiben wir ein innovatives Verfahren zur Bestimmung des Längenpolymorphismus des CR1-Rezeptors. Der Rezeptor enthält drei Domänen, sogenannte lange homologe Wiederholungen (LHR) -LHR-A, LHR-C und LHR-D- und eine n-Domäne, LHR-B, wobei n eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 ist. Unter Verwendung eines einzelnen Paares Von spezifischen Primern wird das genetische Material verwendet, um ein erstes Fragment der LHR-B-Domäne zu amplifizieren (thE-Variante Amplicon B) und ein zweites Fragment der LHR-C-Domäne (das invariante Amplicon). Die Variante Amplicon B und die invariante Amplicon zeigen Unterschiede bei fünf Nukleotiden außerhalb der Hybridisierungsbereiche der Primer an. Die Anzahl der Varianten-Amplifikate B und der invarianten Amplifikate wird mit einem quantitativen Werkzeug (hochauflösende Schmelz- (HRM-) Kurven abgeleitet und das Verhältnis der Variante amplicon B zum invarianten Amplicon unterscheidet sich nach dem CR1-Längenpolymorphismus. Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber dem kanonischen Phänotyp-Verfahren, da es kein frisches Material erfordert und billiger, schneller und daher für größere Populationen gilt. Daher sollte die Verwendung dieser Methode hilfreich sein, um die Rolle der CR1-Isoformen bei der Pathogenese von Krankheiten wie AD besser zu verstehen.

Introduction

AD, die häufigste Ursache für Demenz, betrifft mehr als 30 Millionen Menschen auf der ganzen Welt und ist ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit 1 . Klinisch ist AD durch neurokognitive Störungen gekennzeichnet, die zu einem fortschreitenden Verlust der Autonomie führen 2 . AD zeichnet sich durch zwei neuropathologische Kennzeichen aus, nämlich extrazelluläre Amyloidablagerungen und intrazelluläre neurofibrilläre Tangles 3 .

Traditionell, nach dem Alter des Beginns der Krankheit, AD wird in zwei Formen klassifiziert. Zuerst ist Anfang des Anfangs AD (EOAD), wo der Beginn am häufigsten vor dem Alter von 65 Jahren auftritt; Dieses Formular macht weniger als 5% der AD-Fälle aus. Es handelt sich um eine seltene autosomal-dominante Form von AD, die entweder vollständig im Amyloidvorläuferprotein ( APP) 4 , Presenilin 1 ( PSEN1 ) 5 oder Presenilin 2 ( PSEN2 )> 6 Gene. Zweitens wird die häufigere Form der Erkrankung (> 90% der AD-Fälle) als "sporadische" Spätstart AD (LOAD) bezeichnet und tritt meist bei Personen ab 65 Jahren auf. Es resultiert aus mehreren genetischen und umweltbedingten Risikofaktoren 7 . In LOAD ist das 4-Allel des Apolipoprotein E ( APOE ) -Gens der wichtigste genetische Risikofaktor 8 , 9 . Darüber hinaus wurden mehr als 20 Gen-Loci durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) identifiziert, die mit dem Risiko von AD assoziiert sind, von denen eines das Komplementkomponente (3b / 4b) -Rezeptor 1 ( CR1 ) -Gen 10 ist Chromosom 1q32 in einem Cluster von komplementabhängigen Proteinen. Das CR1- Gen kodiert für das Komplementrezeptortyp 1 (CR1) -Protein, eine Komponente der Komplementaktivitätsregulatoren.

CR1 (der C3b / C4b-Rezeptor, CD35), ein Transmembran-Glykoprotein von approximatEly 200 kDa 11 , bindet an die C3b, C4b, C3bi, C1q, Mannan-bindende Lektin (MBL) und Ficolin-Komplement-Proteine 12 . Die biologische Funktion von CR1 variiert mit den Zelltypen, in denen es exprimiert wird. Beim Menschen werden 90% des gesamten zirkulierenden CR1 in roten Blutkörperchen gefunden (RBCs) 13 . Gegenwärtig an der Oberfläche von RBCs bindet CR1 an C3b- oder C4b-opsonisierte Mikroorganismen oder Immunkomplexe, was ihre Freisetzung aus dem Kreislauf erleichtert. Komplexe, die an CR1 gebunden sind, werden tatsächlich in Phagozyten übertragen, wenn RBCs durch die Leber und Milz 11 , 14 gehen . Durch die Begrenzung der Abscheidung von C3b und C4b kann CR1 eine übermäßige Komplementaktivierung verhindern. Daher wird die Expression von CR1 auf RBCs als ein wesentliches Element beim Schutz von Geweben wie dem zerebralen Nervensystem, gegen die Immunkomplexablagerung und die daraus resultierenden Krankheiten angesehen. Das CR1 auf RBCs ist auch bekanntEine wichtige Rolle bei der pathogenen Infektion spielen 15 , 16 . Darüber hinaus ist CR1 als wichtiger Akteur der angeborenen Immunität an der Regulierung der Komplementkaskade und am Transport und der Clearance von Immunkomplexen beteiligt. CR1 übt diese Aktivität durch Bindung von C3b- und C4b-Fragmenten aus und dissoziiert klassische und alternative Konvertierungen (Dissoziation von C2a aus dem C4b2a-Komplex und Dissoziation von C3b aus dem C3bBb-Komplex). Als Cofaktor des Plasma-Serin-Protease-Faktors I (FI) hemmt CR1 die klassischen und alternativen Komplementwege durch Erhöhung der Spaltung von C4b und C3b durch FI, einer als Cofaktor-Aktivität (CA) bekannten Eigenschaft und durch Inhibierung der C3-Amplifikationsschleife , Was wiederum eine weitere Komplementaktivierung verhindert. Rogers und Kollegen belegen, dass das A & bgr; -Peptid den Komplementpfad in Abwesenheit von Antikörpern 17 binden und aktivieren kann und dass das A & bgr; -Peptid cl istAus der Zirkulation über komplementabhängige Adhärenz an die CR1, ausgedrückt auf RBCs 18 .

CR1 zeigt drei Arten von Polymorphismen: Struktur- oder Längenpolymorphismen, Dichtepolymorphismen und Knops Blutgruppen-Polymorphismen 11 , 19 . Der strukturelle Polymorphismus bezieht sich auf eine Variation der Anzahl der langen homologen Wiederholungen (LHRs) und definiert somit vier Isoformen. Tatsächlich besteht die extrazelluläre Domäne des CR1-Proteins aus einer Reihe von Wiederholungseinheiten, die als kurze Konsensus-Wiederholungen (SCRs) oder Komplement-Kontrollwiederholungen (CCPs) bezeichnet werden. Diese SCRs wurden aus der für CR1 kodierenden Komplement-Desoxyribonukleinsäure (cDNA) nachgewiesen. Die SCRs sind in Tandemgruppen von sieben, bekannt als LHRs angeordnet. CR1 ist in vier LHRs, die als LHR-A, -B, -C und -D bezeichnet werden, angeordnet, die aus der Vervielfältigung einer sieben-SCR-Einheit 19 , 20 ,21

In zunehmender Reihenfolge der Frequenz sind diese durch Western Blot (WB) bestimmten CR1-Isoformen CR1 * 1 (A / F) (schnelle Migration auf Gelelektrophorese), CR1 * 2 (B / S) (langsame Migration auf Gelelektrophorese), CR1 * 3 (C / F`) und CR1 * 4 (D). Die beiden häufigsten Isoformen CR1 * 1 (A / F) und CR1 * 2 (B / S) bestehen aus vier bzw. fünf LHRs, während CR1 * 3 (C / F`) und CR1 * 4 (D ) Bestehen aus 3 bzw. 6 LHRs. Die häufigste Isoform (CR1 * 1), bestehend aus 30 SCRs, enthält drei C4b-Bindungsstellen (SCRs 1-3; 8-10 und 15-17) und zwei C3b-Bindungsstellen (SCRs 8-10 und 15-17) , Während die SCRs 22-28 C1q, Ficoline und MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 binden. Somit enthält CR1 * 2 eine weitere C3b / C4b-BindungsstelleD zu CR1 * 1. Abbildung 1 zeigt die Strukturen, Nomenklaturen und Molekulargewichte der vier verschiedenen Isoformen von CR1.

Der Dichtepolymorphismus entspricht einem stabilen Phänotyp, der den Grad der konstitutiven Expression von CR1 auf RBCs darstellt. Bei gesunden kaukasischen Probanden wurde gezeigt, dass die Anzahl der CR1-Moleküle pro RBC bis zu einem Faktor von zehn variieren kann (variiert von 150 bis 1.200 Moleküle pro Zelle) 26 . RBCs des Helgeson-Phänotyps haben eine sehr niedrige CR1-Dichte, die als niedriger als 150 Moleküle pro Zelle 27 , 28 gezeigt wurde . Die CR1-Dichte an RBCs ist genetisch mit einem autosomalen codominanten Biallelsystem auf dem CR1- Gen assoziiert, das mit einem Hin- dIII-Restriktionsfragment-Länge-Polymorphismus (RFLP) 29 korreliert ist. Eine Einpunktmutation in Intron 27 des CR1-Gens, zwischen den für das zweite kodierenden ExonsSCR in LHR-D, führt zur Erzeugung einer polymorphen HindIII – Stelle innerhalb dieser Region 30. Genomische HindIII – Fragmente von 7,4 und 6,9 kDa identifizieren Allelen assoziiert mit hohem (H – Allel) oder niedrig (L – Allel) CR1 – Dichte auf RBCs, respectively. Jedoch wurde keine Korrelation zwischen der CR1-Dichte auf RBCs und Hin- dIII-Polymorphismen in einigen westafrikanischen Populationen 31 , 32 gefunden . Der Mechanismus, der die CR1-Dichteregulation mit einem nicht-kodierenden Hin- dIII-Polymorphismus verbindet, bleibt unbekannt. Unter mehreren Polymorphismen wurde berichtet, dass Q981H in SCR16 und P1786R in SCR28 an die CR1-Dichte an den RBCs 30 , 33 gebunden sind.

Der Knops (KN) Polymorphismus, nach der internationalen Nomenklatur, ist das 22. Blutgruppen-System, das von der Internationalen Gesellschaft für Blut-Transfusion indiziert werden soll. Es enthält 9 antigene SpeziesDie durch das CR1 auf RBCs ausgedrückt werden, darunter drei antithetische antigene Paare, KN1 / KN2, KN3 / KN6 und KN4 / KN7 sowie 3 isolierte Antigene, KN5, KN8, KN9. Die KN1-, KN3-, KN4- und KN5-Antigene sind hochfrequente Antigene des KN-Systems ( dh in mehr als 99% der Gesamtbevölkerung ausgedrückt). Allerdings bleibt die Rolle dieses Polymorphismus im AD zu bestimmen 13 .

Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die CR1-Länge-Polymorphismus-Genotypen zu bestimmen, die an der Anfälligkeit für mehrere Krankheiten beteiligt sind, wie AD, systemischer Lupus erythematodes und Malaria. Unsere Methode für die CR1-Länge-Polymorphismus-Bestimmung nutzt die Anzahl der LHR-Bs mit den CR1-Isoformen und den Sequenzunterschieden zwischen LHR-B und LHR-C ( Abbildung 2 ).

Protocol

Das Protokoll für die Blutentnahme und -behandlung wurde durch den regionalen Ethikausschuss (CPP Est II) überprüft und genehmigt, und die Protokollnummer ist 2011-A00594-37. HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Behandlung von menschlichem Blut. Bitte befolgen Sie die institutionellen Richtlinien bei der Entsorgung von biologisch gefährlichem Material. Labor-Sicherheitsausrüstung, wie Laborkittel und Handschuhe, sollten getragen werden. Ein Flussdiagramm, das das Protokoll beschreibt, ist in Abbildung 3 dargestellt . 1. Blut- und Körperflüssigkeits-DNA-Extraktion 20 μl Proteinase K (15 μg / μL) in den Boden eines 1,5 mL Röhrchens pipettieren. Füge 200 μl Probe zum 1,5-ml-Röhrchen hinzu. Verwenden Sie bis zu 200 μl Vollblut, Plasma, Serum, Buffy Coat oder Körperflüssigkeiten oder bis zu 5 x 10 6 Lymphozyten in 200 μl PBS. Füge 200 μl Lysepuffer zur Probe hinzu. Mischen durch Puls-Vortexen für 15 s. Inkubieren bei 56 ° C für 10 min in einem Wasserbad. Die 1,5 mL Röhre kurz zentrifugieren, um die Tropfen von der Innenseite des Deckels zu entfernen. Füge 200 μl Ethanol (96-100%) zu der Probe hinzu und vermische erneut durch Puls-Vortexen für 15 s. Nach dem Mischen kurz das 1,5 mL-Röhrchen zentrifugieren, um die Tropfen von der Innenseite des Deckels zu entfernen. Die Mischung aus Schritt 1.6 sorgfältig auf die Membransäule auftragen (in einem 2 ml Sammelröhrchen). Ohne die Felge zu benetzen, die Kappe zu schließen und bei 6000 xg für 1 min zu zentrifugieren. Setzen Sie die Membransäule in ein sauberes 2-ml-Sammelrohr und entsorgen Sie das Röhrchen, das das Filtrat enthält. Die Membransäule vorsichtig öffnen und 500 μl Waschpuffer 1 geben, ohne die Felge zu benetzen. Schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie bei 6.000 xg für 1 min. Legen Sie die Membransäule in ein sauberes 2 ml Sammelröhrchen und entsorgen Sie das Röhrchen, das das Filtrat enthält. Öffnen Sie die Membransäule vorsichtig und fügen Sie 500 μl Waschpuffer 2 ohne Benetzung hinzuE rim Schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie mit voller Geschwindigkeit (20.000 xg) für 3 min. Die Membransäule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen geben und das Sammelröhrchen mit dem Filtrat verwerfen. Zentrifuge bei 20.000 xg für 1 min. Legen Sie die Membransäule in ein sauberes 1,5 mL Röhrchen und entsorgen Sie das Sammelröhrchen, das das Filtrat enthält. Die Membransäule vorsichtig öffnen und 200 μl destilliertes Wasser zugeben. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min und dann bei 6000 xg für 1 min zentrifugieren. Zur Bestimmung des DNA-Konzentrationsschrittes gehen oder die DNA-Proben bei -20 ° C einfrieren 2. Bestimmung der DNA-Konzentration HINWEIS: Siehe Abbildung 4 . Drücken Sie 1, um den DNA-Modus auf einem Spektrophotometer auszuwählen. Wählen Sie mit den Links- und Rechtspfeilen eine Länge von 5 mm aus. Wählen Sie mit den Links- und Rechtspfeilen einen Verdünnungsfaktor von 1 aus. Wählen Sie die Einheit (μg / mL) mit thE linke und rechte Pfeile. Wählen Sie mit den Links- und Rechtspfeilen einen Faktor von 50 aus. Drücken Sie OK . 10 μl destilliertes Wasser in die Küvette pipettieren. Setzen Sie die Küvette in das Spektrophotometer. Drücken Sie die Taste OA / 100% T. 10 μl der DNA Probe (1/4 Verdünnung in destilliertem Wasser) in die Küvette pipettieren. Setzen Sie die Küvette in das Spektrophotometer. Drücken Sie die grüne Taste (lesen / starten). Beachten Sie die Konzentration. Die DNA-Probe bei -20 ° C einfrieren. 3. HRM-PCR-Protokoll Tauen Sie die DNA-Proben auf. Die DNA-Proben in 1,5 ml Röhrchen mit Wasser verdünnen, um sie auf eine Konzentration von 10 ng / μL einzustellen HINWEIS: Das Gesamtvolumen der verdünnten DNA sollte zwischen 2 μl und 10 μl liegen. Tauen Sie die Primerlösungen auf. Die Primerlösungen in 1,5-ml-Röhrchen mit Wasser verdünnen, um sie auf die gleiche Konzentration von 6 μM einzustellen. HINWEIS: Die Primer-Sequenzen und Reaktionsbedingungen sind in T angegebenFähig 1 Tabelle 1: Primer und Parameter, die in der hochauflösenden Schmelzanalyse verwendet werden. Tauen Sie die HRM-PCR-Kit-Lösungen auf und mischen Sie sorgfältig durch Vortexen, um die Wiederherstellung aller Inhalte zu gewährleisten. Kurz drehen die drei Phiolen die enzymatische Mischung mit der DNA – Bindungsfarbstoff, MgCl 2, und Wasser in einer Mikro die sie enthalten vor dem Öffnen. Bei Raumtemperatur aufbewahren. In einem 1,5 ml-Röhrchen bei Raumtemperatur wird die PCR-Mischung für eine 20 μl-Reaktion durch Zugabe der folgenden Komponenten in der nachfolgenden Reihenfolge hergestellt: 10 & mgr; l enzymatisches Gemisch mit DNA-Bindungsfarbstoff; 2 & mgr; l 25 mM MgCl 2 ; 1 & mgr; l Primer 1, 6 & mgr; M (Endkonzentration: 300 nM); 1 μl Primer 2, 6 μM (Endkonzentration: 300NM); und 5 μl Wasser. HINWEIS: Um die PCR-Mischung für mehr als eine Reaktion vorzubereiten, multiplizieren Sie die Volumina oben mit der Anzahl der zu laufenden Reaktionen und einer zusätzlichen Reaktion. Mischen Sie vorsichtig durch Vortexen. Pipet 19 μl PCR-Mischung, oben hergestellt, in jede Vertiefung einer weißen Multiwell-Platte. Füge 1 μl konzentrationsbereinigte DNA-Matrize hinzu, die in Schritt 3.1 hergestellt wurde. HINWEIS: Für Kontrollreaktionen immer eine Negativkontrolle mit den Samples ausführen. Um eine Negativkontrolle vorzubereiten, ersetzen Sie die Template-DNA durch Wasser. Die weiße Multiwellplatte mit Dichtfolie abdichten. Legen Sie die weiße Multiwellplatte in die Zentrifuge und balancieren Sie sie mit einem geeigneten Gegengewicht ( dh einer anderen Multiwellplatte). Zentrifuge für 1 min bei 1.500 xg in einer Standard-Schwenkschaufel-Zentrifuge mit einem Rotor für Multiwell-Platten mit geeigneten Adaptern. Legen Sie die weiße Multiwellplatte in das HRM-PCR-Instrument ein. Starten Sie das HRM-PCR-Programm mit folgenden PCR-Bedingungen: Denaturierung: 95 ° C für 10 min; 1 Zyklus Amplifikation: 95 ° C für 10 s, 62 ° C für 15s und 72 ° C für 20s; 47 Zyklen. Schmelzkurve: 95 ° C; Rampenzahl: 0,02 ° C / s; 25 Akquisitionen pro ° C; 1 Zyklus Kühlung: 40 ° C für 30 s; Rampenzahl 2,2 ° C / s; 1 Zyklus 4. HRM-Analyse zur Bestimmung der CR1-Länge Polymorphismus HINWEIS: Die beschriebene Methodik ( Abbildung 5 ) ist spezifisch für unsere Software (siehe Tabelle der Materialien ), obwohl andere Softwarepakete verwendet werden können. Öffnen Sie eine Gen-Scanning-Software, um die CR1-Länge-Polymorphismus-Scanning-Analyse durchzuführen. Öffnen Sie das Experiment mit dem Verstärkungsprogramm und dem Schmelzkurvenprogramm. Klicken Sie auf Sample Editor in der Modulleiste und wählen Sie dann SKonserven Workflow. Definieren Sie die Eigenschaften der Samples ( dh Name, Unbekannte oder Negativkontrolle). Klicken Sie auf Analyse in der Modulleiste. Wählen Sie in der Liste Neue Analyse erstellen die Option Gene Scanning aus. Klicken Sie auf die Registerkarte , um die Normalisierungsschmelzkurven zu normalisieren. Klicken Sie auf die Registerkarte Temperaturverschiebung , um die Temperaturachse (x-Achse) der Schmelzkurven zurückzusetzen. HINWEIS: Die untere Grafik zeigt Schmelzkurven, die sowohl normalisiert als auch temperaturverschoben sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen , um die Ergebnisse zu analysieren und die Gruppierung zu bestimmen. Klicken Sie auf die Registerkarte Differenz-Plot im Diagrammbereich, um die normalisierten und verschobenen Schmelzkurven und die normalisierte und temperaturverschobene Differenzkurve anzuzeigen .

Representative Results

Abbildung 6 a zeigt die Phänotypisierung des CR1 – Längenpolymorphismus von WB. Abbildung 6 B und C zeigen die Kurven, die während der HRM-PCR-Analyse erhalten werden, was die Bestimmung des CR1-Längenpolymorphismus ermöglicht. Die Analyse der Fusionskurven unter Verwendung der Software nach dem hochauflösenden Schmelzen der PCR-abgeleiteten Amplikone aus der genomischen DNA von Probanden mit unterschiedlichen CR1-Isoformen erzeugt Kurven, die die Subjekte nach ihren allotypischen CR1-Expressionsphänotypen unterscheiden. Figur 6 B zeigt eine erste Art der Präsentation, genannt „Normalized und Shifted Schmelz Curves“ , während Figur 6 C einen zweiten Darstellungsweise zeigt, die so genannten „Normalized und Temp verschobene Differenzdiagramm.“ <p class="jove_content" fo:keEp-together.within-page = "1"> Die Profile der Kurven werden nach den Gruppen verteilt, die die in Abbildung 6 A dargestellten Phänotypen darstellen: (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Und (CR1 * 2, CR1 * 4). Dies ermöglicht die Genotypisierung des CR1-Längenpolymorphismus mit dieser neuen molekularbiologischen Methode. Abbildung 1: Schematische Darstellung der Struktur und Polymorphismen des Komplement-Rezeptor-1-Proteins. Jedes kurze Konsensus-Repeat (SCR) oder Komplement-Kontrollprotein (CCP) wird durch einen Kreis dargestellt. Die SCRs werden in eine repetitive, höherwertige Strukturen mit dem Namen LHRs gruppiert. Von der extrazellulären Domäne bis zur Zellmembran sind die LHRs: LHR-A, -B, -C, -D und -S (ergänzende oder zusätzliche LHR). In der gängigsten CR1-Isoform(CR1 * 1) befindet sich die Bindungsstelle C4b / Zerfallsbeschleunigungsaktivität (DAA) bei LHR-A (SCRs 1-3, grüne Kreise), die C3b / C4b / Cofaktor-Aktivität (CA) -Bindungsstelle befindet sich im 3 N-terminale SCRs von LHR-B (SCRs 8-10, rote Kreise) und LHR-C (SCRs 15-17, purpurrote Kreise) und die Bindungsstelle für C1q / MBL und Ficolin finden sich im LHR-D (SCRs 22-28, blaue Kreise). Die homologen Strukturen sind identisch gefärbt. Die CR1 * 2 (S) Isoform stellt ein zusätzliches LHR (LHR-S) dar und enthält somit eine zusätzliche C3b / C4b-Bindungsstelle. KDa, Kilodalton. NRC, nicht reduzierte Bedingungen. RC, reduzierte Bedingungen. TM, Transmembran-Domäne. Diese Figur wurde von Brouwers et al. 36 mit Genehmigung von Nature Publishing Group. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src= "/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" /> Abbildung 2 : Schematische Darstellung der CR1-Isoformstruktur mit Sequenz-Amplicon-Positionen, die durch HRM-PCR erhalten wurden. Jede Box repräsentiert einen SCR. Die SCRs sind in LHRs gruppiert: LHR-A, -B, -C und -D. Die homologen Strukturen sind identisch gefärbt. Die CR1 * 2 und CR1 * 4 Isoformen stellen zusätzliche LHRs (LHR-B) dar und enthalten somit einen zusätzlichen Amplikonbereich (Amplicon B, in Rot). CR1 * 3 fehlt LHR-B und enthält weniger amplicon Bereich (fehlende Amplicon B). Nukleotidunterschiede zwischen Amplicon B (196 bp) und dem invarianten Amplicon (197 bp) sind jeweils in Rot bzw. Blau dargestellt. Unterschiede im Verhältnis: (amplicon B, in rot / invariantem Amplicon, in blau) zwischen jeder CR1-Isoform werden durch die HRM-PCR bestimmt, was die Genotypisierung ermöglicht. Die CN3- und CN3re-Primer-Sequenzen sind unterstrichen. TM, Transmembran-Domäne. CYT, zytoplasmatischer SchwanzPg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Flussdiagramm des Protokolls zur Genotypisierung des CR1-Längenpolymorphismus aus menschlichen Blutproben Sammle eine menschliche DNA Probe. Extrahieren Sie die DNA, um eine DNA-Blutprobe zu erhalten. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und verdünnen Sie, um die DNA-Konzentration bei 10 ng / μL zu erhalten. Verwenden Sie HRM-PCR, um den CR1-Länge-Polymorphismus-Genotyp zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4 : Screenshots des Spektrophotometers uns Um die DNA-Konzentration zu bestimmen. Drücken Sie 1 ( A ), um den DNA-Modus auf dem Spektrophotometer auszuwählen. Wählen Sie eine 5 mm Pfadlänge ( B ) mit den linken und rechten Pfeilen ( C ). Wählen Sie die Einheit (μg / mL) ( D ) mit den Pfeiltasten links und rechts ( C ). Verdünnungsfaktor 1 ( E ) mit den Links- und Rechtspfeilen ( C ) auswählen. Wählen Sie mit den Links- und Rechtspfeilen einen Faktor von 50 ( F ) aus. Drücken Sie OK ( G ). 10 μl destilliertes Wasser in die Küvette pipettieren. Setzen Sie die Küvette in das Spektrophotometer ( H ). Drücken Sie die Taste OA / 100% T ( I ). 10 μl DNA Probe (1/4 Verdünnung in destilliertem Wasser) in die Küvette pipettieren. Setzen Sie die Küvette in das Spektrophotometer ( K ). Drücken Sie die grüne Taste (lesen / starten) ( L ). Beachten Sie die Konzentration ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5: Screenshots der grafischen Oberfläche der Software, die in Schritt 4 des Protokolls verwendet wird. ( A ) Öffnen Sie die Gen-Scanning-Software. ( B ) Verstärkungsprogramm und Schmelzkurvenprogramm. (C) Klicken Sie auf Sample – Editor in der Modulleiste. ( D ) Wählen Sie Scannen . ( E ) Definieren Sie die Eigenschaften der Proben. (F) Klicken Sie auf Analyse in der Modulleiste. (G) Klicken Sie auf die Registerkarte , um die Normalisierungsschmelzkurven zu normalisieren. ( H ) Klicken Sie auf die Registerkarte Temperaturverschiebung , um die Schmelzkurven zu zeigen, die beide sindNormalisiert und temperaturverschoben. ( I ) Klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen , um die Ergebnisse zu analysieren und die Gruppierung zu bestimmen. ( J ) Klicken Sie auf die Registerkarte Differenz-Diagramm , um die normalisierten und verschobenen Schmelzkurven und die normalisierte und temperaturverschobene Differenzkurve anzuzeigen . ( K ) Farbige Gruppierung der Proben nach den CR1-Längengenotypen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 6: Phänotypisierung der im WB beobachteten CR1-Längenpolymorphismen und deren entsprechende Profilkurven, die durch HRM-PCR erhalten wurden. ( A ) Phänotypisierung der CR1-Längenpolymorphismen unter Verwendung von WB. ( B </stRong>) und ( C ) Genotypisierung von CR1-Längenpolymorphismen mittels HRM-PCR-Analyse. Die HRM-Kurvenanalyse von PCR-Amplifikaten, die aus der genomischen DNA von Probanden erhalten wurden, die unterschiedliche CR1-Isoformen zeigten, führte zur Identifizierung spezifischer Kurvenprofile: (CR1 * 3, CR1 * 1) (violett); (CR1 * 1, CR1 * 2) (blau); CR1 * 1 (grün); CR1 * 2 (rot); Und (CR1 * 2, CR1 * 4) (grau). Diese entsprechen den CR1-Länge-Polymorphismus-Allelen. Wie aus den beiden Darstellungsarten hervorgeht: "Normalisierte und verschobene Schmelzkurven" (B) und "Normalisierte und Temp-Shifted Difference Plot" (C) – die Kurvenprofile werden nach dem (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Und (CR1 * 2, CR1 * 4) Gruppen. Diese Figur wurde von Mahmoudi et al. 38 mit Erlaubnis von Elsevier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Hier beschreiben wir eine weit verbreitete Methodik, um CR1-Längenpolymorphismen zu untersuchen. Die molekularbiologischen Techniken zur Amplifikation oder segmentalen Hybridisierung waren niemals in der Lage, zufriedenstellende Ergebnisse zu liefern, die die Bestimmung von CR1-Längenpolymorphismen bei allen Individuen ermöglichen. Dies liegt an der repetitiven Struktur des CR1-Gens ( dh der hoch repetitiven SCRs von CR1). Das hier beschriebene molekularbiologische Verfahren nutzt die quantitative Verteilung von LHR-B im CR1-Molekül aus. Das CR1-Molekül schließt n LHR-B-Domänen ein, wobei n eine Zahl zwischen 0 und 3 und nur eine LHR-C-Domäne ist, wie in Fig. 2 beschrieben und dargestellt. Die quantitative Domäne B-Erkennung macht es möglich, eine zusätzliche oder fehlende Domäne B perfekt zu unterscheiden.

Aus dem extrahierten genetischen Material wird ein erstes DNA-Fragment aus LHR-B durch PCR unter Verwendung eines einzelnen Paares spezifischer Primer amplifiziert, repräsentiertEine charakteristische Variante von LHR-B genannt "Variante amplicon B." Ein zweites DNA-Fragment, das sogenannte "invariante Amplicon", das zu LHR-C gehört, wird ebenfalls amplifiziert. Dieses zweite DNA-Fragment ist ein Fragment von LHR-C, aber auch ein anderes invariantes Fragment von LHR-A oder -D könnte verwendet werden.

Die beiden DNA-Fragmente, das Varianten-Amplicon B und das invariante Amplicon, werden durch die gleichen Primer amplifiziert und zeigen fünf Unterschiede in den Nukleotidsequenzen. Diese Eigenschaft macht es möglich, in der nachfolgenden Stufe die Anzahl der Varianten amplicon B und die Anzahl der invarianten Amplikatoren unter Verwendung eines quantitativen molekularbiologischen Werkzeugs, HRM, zu bestimmen, das zu diesem Zweck angepasst wurde. Das Verhältnis zwischen der Anzahl von Amplicon B und dem invarianten Amplicon (Verhältnis: Amplicon B / Invariante Amplicon) variiert je nach Länge des CR1-Moleküls. In der Tat zeigt CR1 * 4 3 amplicon B-Einheiten zu 1 invariantem Amplicon, CR1 * 2 zeigt 2 Amplicon B-Einheiten zu 1 invariantem Amplicon, CR1 * 1 zeigt 1 Amplikon B bis 1 invariantes Amplicon und CR1 * 3 zeigt 0 Amplifikationen B Einheiten zu 1 invariantem Amplicon ( Abbildung 2 ). Somit ermöglicht dieses HRM-PCR-Verfahren die Genotypisierung des CR1-Längenpolymorphismus.

Trotzdem erfordert diese Technik zu Beginn der Studie die Verwendung von Referenzpersonen, deren CR1-Phänotypen bereits bekannt sind ( dh zuvor von WB etabliert), um die Genotypisierung von CR1 nach dem Referenzprofil der erhaltenen Kurven festlegen zu können Von HRM-PCR. Es gibt zwei Darstellungsarten, nämlich "Normalisierte und verschobene Schmelzkurven" und "Normalisierte und Temp-Shifted Difference Plot". Sie zeigen verschiedene Gruppen von Kurvenprofilen, die gemäß dem durch WB erhaltenen CR1-Länge-Polymorphismus-Phänotypen gefärbt sind ( Fig. 6 ). Aus dem Schritt "Normalisierte und verschobene Schmelzkurven" ist es möglich, unsere Methode zu unterscheidenE verschiedene Gruppen von Kurven entsprechend den Isoformen von CR1, gruppiert nach Farbe. Allerdings ermöglicht die "Normalisierte und Temp Shifted Difference Plot", die einer anderen mathematischen Darstellung entspricht, die leichtere Visualisierung der verschiedenen Kurvengruppen. Obwohl die Software des Herstellers routinemäßig in dieser Studie verwendet wurde, könnte andere Software (wie uANALYSE) als Datenextraktionsprogramm für die Kurvenanalyse verwendet werden.

Bis heute ist die WB-Analysetechnik die ursprüngliche Technik, die die Identifizierung der verschiedenen CR1-Längenpolymorphismen auf der Ebene des Proteins ermöglicht. Diese Technik hat jedoch eine Reihe von Nachteilen. Insbesondere kann die Proteinanalyse nach WB erst nach der Extraktion der Zellmembranen erfolgen. Damit ist es kompliziert und zeitaufwändig. Darüber hinaus erfordert diese Technik das Erhalten einer frischen Blutprobe unter geeigneten Bedingungen zu Beginn des Verfahrens, um nützliche Res zu erreichenUlts Im Gegenteil, HRM-PCR auf DNA durchgeführt macht es möglich, auch trockene Blutflecken oder Proben nach Langzeitlagerung zu verwenden. HMR-PCR erfordert ein spezialisiertes DNA-Schmelzgerät, entweder ein spezielles Instrument oder ein HMR-Kapazität Thermocycler mit HRM-Software. SNP-Detektion ist abhängig von mehreren Faktoren: i) SNPs, die in großen PCR-Fragmenten enthalten sind, sind schwerer zu erkennen als die gleichen SNPs in kleinen PCR-Fragmenten; Ii) SNPs der Klassen III und IV sind schwerer zu erkennen als die der Klassen I und II 34 ; Und iii) SNPs, die von der Nah-Nachbar-Basissymmetrie flankiert werden ( zB 5'-G (G / C) C-3 '), können nicht durch Schmelzen sortiert werden, unabhängig von der Auflösungsleistung der HMR-Plattform. Es kann nützlich sein, die vorhergesagten PCR-Fragmente, die das interessierende SNP enthalten, mit der uMELT-Software 35 zu testen, um die Gültigkeit des Assays zu beurteilen. Schließlich ist HMR-PCR eine analoge Methode, was bedeutet, dass die Ähnlichkeit der Schmelzkurven wettenEine Referenz und eine Schablone bedeutet nicht zwangsläufig, dass die Schablonenfolge mit der Referenz identisch ist, da die Schablonenfolge von der Referenz aber thermodynamisch äquivalent sein kann. Diese Einschränkungen gelten jedoch nicht für das hier beschriebene Verfahren, das auf dem Schmelzen einer Mischung von Amplifikaten beruht, die sich von 5 Nukleotidsequenzen unterscheiden.

Darüber hinaus hat die hier beschriebene Technik, basierend auf der Analyse von HRM, viele Vorteile. Zuerst werden die CR1-Längenpolymorphismen schneller bestimmt, da die Ergebnisse in etwa 2 h erhalten werden, sobald die Extraktion des genetischen Materials durchgeführt worden ist. Umgekehrt erfordern traditionelle biochemische Techniken, die auf der WB-Proteinanalyse basieren, Schritte, die relativ lang sind: die Elektrophorese von Zellmembran-Extrakten durch ein Acrylamidgel, einen Schritt zum Übertragen von Proteinen auf eine Nitrocellulose- oder Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran und einen Schritt zur Identifizierung der Isoformen derCR1-Molekül durch Immunochemilumineszenz. Zweitens hat die HRM-PCR-Technik auch den Vorteil, dass sie nicht zu teuer ist, was besonders wichtig ist für eine Methode, die wahrscheinlich auf viele Einzelpersonen ( dh Largescale) angewendet wird, um ihre Anfälligkeit für die Entwicklung von Pathologien wie Alzheimer-Krankheit, Lupus oder Malaria.

In letzter Zeit haben wir und andere gezeigt, dass die CR1 * 2-Isoform, die eine zusätzliche C3b / C4b-Bindungsstelle enthält, mit AD 36 , 37 , 38 assoziiert war. In unserer bisher veröffentlichten Studie waren die CR1-Längenpolymorphismen auf der Ebene des Gens und des Proteins bei 98,9% der Probanden 38 konsistent. Die diskordanten Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn Vergleichslängenpolymorphismen, die durch HRM-PCR erhalten wurden, mit denen, die durch WB erhalten wurden, korrespondierten Patienten mit einem (HR1 * 1, CR1 * 2) Genotypprofil, bestimmt durch HRM (Gen), aber exDrücken Sie nur die CR1 * 1 Isoform an der Oberfläche des Erythrozyten nach WB (Protein). In unserer Studie war der Mangel an CR1 * 2-Isoform-Expression (Individuen, die ein Silent-Allel tragen) reproduzierbar, wenn das WB mit einer längeren Expositionszeit durchgeführt wurde und durch die Existenz eines Silent-CR1-Allels (CR1 * 2) erklärt werden konnte In der Literatur von Helgeson 39 . Trotzdem sind weitere Studien zu größeren Populationen erforderlich, um diese Hypothese zu unterstützen.

Es sollte beachtet werden, dass private SNPs (SNPs, die nur in einer kleinen Familiengruppe oder sogar in einer Einzelperson auftreten) zu deutlichen Kurvenprofilen geführt haben, die mit Hilfe der Referenzphänotypbestimmung (WB) entschlüsselt werden sollten, aber das kann nicht mit dem kanonischen Profil verwechselt werden, um zu vermeiden Jede Fehlinterpretation des CR1-Länge-Polymorphismus-Genotyps.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken allen Mitgliedern der Plateforme Régionale de Biologie Innovante, den Mitarbeitern der Abteilung für Immunologie und den Mitarbeitern der Abteilung für Innere Medizin und Geriatrie, die zur Optimierung und Validierung des Protokolls beigetragen haben. Diese Arbeit wurde von den Reims Universitätskliniken (Zuschussnummer AOL11UF9156) finanziert. Wir danken auch Fiona Ecarnot (EA3920, Universitätsklinikum Besancon, Frankreich) für redaktionelle Unterstützung.

Materials

Lab coat protection
SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
TipOne 10µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
TipOne 1-100µL bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
ART 1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 51306 DNA Extraction
Buffer AL Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19075 Lysis buffer
QIAamp Mini Spin Column Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 1011706 DNA binding
Buffer AW1 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19081 Wash buffer
Buffer AW2 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19072 Wash buffer
Biowave DNA spectrophotometer Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England 80-3004-70 DNA concentration 
Mikro 200 centrifuge Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany 0002020-02-00 centrifugation
Eppendorf Combitips advanced, 1.0 mL, Eppendorf Biopur Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030089642 distribution
Multipette E3 Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4987000010 distribution
Light Cycler 480 multiwell plate 96, white Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04729692001 reaction place
Light Cycler 480 sealing foil Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04429757001 coverage
Heraeus Megafuge 11R centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 75004412 centrifugation
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 05015278001 high resolution melting polymerase chain reaction
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04909631001 reaction reagents
light cycler 480 SW 1.5.1 software Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis
CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent
CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent
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Kisserli, A., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Duret, V., Mahmoudi, R. High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer’s Disease Gene Susceptibility Assessment. J. Vis. Exp. (125), e56012, doi:10.3791/56012 (2017).
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