Взаимодействие с мРНК из протопластов растений

Эукариоты используют множественные регуляторные пути биогенеза РНК для поддержания клеточных биологических процессов. Среди известных типов РНК мРНК очень разнообразна и обладает кодирующей способностью белков и их изоформ ^1. Путь ПТРГ направляет судьбы пре-мРНК ^{2 , 3} . RBP из разных семейств генов контролируют регуляцию РНК, а в PTGR специфические mRBPs направляют мРНК через прямые физические взаимодействия, образуя функциональные mRNP. Таким образом, идентификация и характеристика mRBPs и их mRNPs имеет решающее значение для понимания регуляции метаболизма клеточной мРНК ^2. За последние три десятилетия различные методы in vitro, включая анализ сдвига электрофоретической подвижности РНК (REMSA), систематическую эволюцию лигандов с помощью экспоненциальных анализов обогащения (SELEX), основанный на библиотечных конструкциях, RNA Bind-n-Seq (RBNS), радиоактивно меченых или количественныхФлуоресцентные анализы связывания РНК, рентгеновская кристаллография и ЯМР-спектроскопия ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} – широко применяются к исследованиям RBP, главным образом из клеток млекопитающих. Результаты этих исследований RBP млекопитающих можно искать через РНК-связывающую базу данных протеина (RBPDB), которая собирает опубликованные наблюдения ¹⁰ .

Хотя эти подходы in vitro являются мощными инструментами, они определяют связанные мотивы РНК из заданного пула последовательностей РНК и поэтому ограничены в их способности обнаруживать новые целевые РНК. То же самое верно и для вычислительных стратегий для прогнозирования генома ОДП, которые основаны на сохранении белковой последовательности и структуры ^15. Чтобы преодолеть это, новый экспериментальный метод haЧто позволяет идентифицировать мотивы РНК, с которыми взаимодействует RBP, а также для определения точного местоположения привязки. Этот метод, называемый «сшивка и иммунопреципитация» (CLIP), состоит из ультрафиолетового сшивания in vivo с последующим иммунопреципитацией ¹¹ . Ранние исследования показали, что фотоактивация ДНК и РНК-нуклеотидов может происходить при длинах волн возбуждения УФ-лучей, превышающих 245 нм. Реакция через тимидин, по-видимому, благоприятствует (ранг в порядке уменьшения фотореактивности: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) ¹² . Используя УФ-излучение с длиной волны 254 нм (УФ-С), было обнаружено, что ковалентные связи между нуклеотидами РНК и остатками белка создаются в пределах лишь нескольких ангстрем (Å). Явление, таким образом, называется «нулевой длиной» сшивки РНК и RBP. За этим может следовать строгая процедура очистки Dure с небольшим фоном ^{13 , 14} .

Стратегия, дополняющая CLIP, заключается в том, чтобы объединить UV-сшивание in vivo с идентификацией белка для описания ландшафта RBP. Ряд таких геномных мРНК-связанных протеомов был выделен из дрожжевых клеток, эмбриональных стволовых клеток (ESCs) и клеточных линий человека ( т.е. HEK293 и HeLa) с использованием этого нового экспериментального подхода, называемого «захват мРНК-взаимодействием» ^{18 , 19 , 20 , 21} . Метод состоит из ультрафиолетового сшивки in vivo с последующей очисткой mRNP и протеомикой на основе MS. Применяя эту стратегию, было обнаружено много новых «лунных светящихся» RBP, содержащих неканонические RBD, и стало ясно, что больше белков обладает способностью связываться с РНК, чем предполагалось ранее«> 15 ^{, 16 , 17.} Использование этого метода позволяет использовать новые приложения и возможность отвечать на новые биологические вопросы при исследовании RBP. Например, недавнее исследование исследовало сохранение связанного с мРНК протеомом (основной RBP Протеом) между клетками дрожжей и человека ²² .

Было обнаружено, что RBP растений уже участвуют в росте и развитии ( например , в посттранскрипционной регуляции времени цветения, циркадных часов и экспрессии генов в митохондриях и хлоропластах) ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29} , Кроме того, предполагается, что они выполняют функции в клеточных процессах, реагирующих на абиотические стрессы ( например, холод, засуха, sa(ABA)) ^{31 , 32 , 33 , 34} . В геноме Arabidopsis thaliana имеется более 200 предсказанных генов RBP, основанных на мотивах мотивов распознавания РНК (RRM) и K homology (KH); В рисе было отмечено около 250 ^{35 , 36} . Примечательно, что многие предсказанные ОСП, по-видимому, уникальны для растений ( например, не ортологий метазоанов примерно до 50% предсказанных ОКРБ Arabidopsis, содержащих домен RRM) ³⁵ , предполагая, что многие могут выполнять новые функции. Функции большинства прогнозируемых ОДП остаются нехарактерными ²³ .

Выделение мРНК-связанных протеомов из этиолированных проростков Arabidopsis , листовой ткани, культивируемых корневых клеток и протопластов листьев мезофилла посредством использованияНедавно был зарегистрирован захват мРНК-взаимодействием ^{38 , 39} . Эти исследования демонстрируют сильный потенциал систематической каталогизации функциональных RBP на заводах в ближайшем будущем. Здесь мы представляем протокол для захвата мРНК-захвата из протопластов растений ( т. Е. Клеток без клеточных стенок). Протопласты мезофилла листа Arabidopsis thaliana являются основным типом листовых клеток. Изолированные протопласты обеспечивают оптимальный доступ к ультрафиолетовому излучению. Этот тип клеток можно использовать в анализах, которые временно экспрессируют белки для функциональной характеристики ^{40 , 41} . Кроме того, протопластика была применена к нескольким другим типам растительных клеток и видам ^{42 , 43 , 44} ( например, Petersson et al ., 2009; Bargmann and Birnbaum, 2010; Hong и др ., 2012).

<P class = "jove_content"> Метод включает в общей сложности 11 шагов ( рисунок 1A ). Сначала собирают протопласты листьев Arabidopsis (этап 1) и затем подвергают ультрафиолетовому облучению с образованием сшитых mRNP (стадия 2). Когда протопласты лизируют в условиях денатурации (этап 3), сшитые mRNPs высвобождаются в буфере для лизиса / связывания и вытягиваются бусинами олиго-d (T) ₂₅ (этап 4). После нескольких раундов строгих промывок mRNP очищают и далее анализируют. Денатурированные пептиды mRBPs расщепляются протеиназой K до того, как сшитые мРНК очищаются и качество РНК проверяется qRT-PCR (этапы 5 и 6). После обработки РНКазой и концентрации белка (стадия 7) качество белка контролируется электрофорезом на основе полиакриламидного геля SDS (SDS-PAGE) и окрашиванием серебром (этап 8). Различие в структурах полос белка может быть легко визуализировано между сшитым образцом (CL) и несшитым образцом (не-CL;Отрицательный контрольный образец из протопластов, который не подвергается УФ-облучению). Идентификация белков достигается с помощью протеомики на основе MS. Белки из образца CL отделяют одномерным электрофорезом на полиакриламидном геле (1D-PAGE) для удаления возможного фонового загрязнения, «расщепляют в геле» в короткие пептиды с использованием трипсина и очищают (этап 9). Нано-фазовая жидкостная хроматография, связанная с масс-спектрометрией (нано-LC-MS), позволяет определять количество определенных белков в мРНК-связанном протеоме (этап 10). Наконец, идентифицированные mRBP характеризуются и каталогизируются с использованием биоинформационного анализа (этап 11).