植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

真核生物は、細胞の生物学的プロセスを維持するために複数のRNA生合成調節経路を使用する。 RNAの既知のタイプのうち、mRNAが非常に多様であり、タンパク質のコード容量を運び、それらのアイソフォーム^1つの選択図PTGR経路は、プレmRNA ^2,3の運命を指示します。異なる遺伝子ファミリーからのRBPがRNAの調節を制御し、PTGRにおいて、特定のmRBPは機能的なmRNPを形成する直接的な物理的相互作用を介してmRNAを誘導する。したがって、mRBPsおよびそれらmRNPsを同定および特徴づけることは過去30年間.Over細胞mRNA代謝²の調節を理解するために重要であり、種々のインビトロ法- RNA電気泳動移動度シフト（REMSA）アッセイ、指数関数的濃縮アッセイによるリガンドの系統的進化含みますライブラリー由来の構築物、RNA Bind-n-Seq（RBNS）、放射性標識または定量的標識蛍光RNA結合アッセイ、X線結晶学、及びNMR分光法は^{、4、5、6、7、8、9} -広く主に哺乳動物細胞から、RBPsの研究に適用されています。哺乳動物RBPのこれらの研究の結果は、公開された観察を収集するRNA結合タンパク質データベース（RBPDB）を介して検索することができる¹⁰ 。

これらのインビトロアプローチは強力なツールであるが、所定のRNAプールからの結合RNAモチーフを決定するため、新しい標的RNAを発見する能力には限界がある。タンパク質配列および構造の保存に基づくゲノム全体のRBPを予測するための計算戦略についても同様である¹⁵ 。これを克服するために、新しい実験方法ha目的のRBPが相互作用するRNAモチーフの同定を可能にし、結合の正確な位置の決定を可能にする。 「架橋および免疫沈降」（CLIP）と呼ばれるこの方法は、インビボ UV架橋およびその後の免疫沈降^{11からなる} 。初期の研究では、DNAおよびRNAヌクレオチドの光活性化は、245nmを超える励起UV波長で起こり得ることが示されている。チミジンを介した反応が好ましいと思われる（光反応性の減少の順にランク：dT≧dC> rU> rC、dA、dG） ¹² 。波長254nm（UV-C）のUV光を用いて、数オングストローム（Å）の範囲でRNAヌクレオチドとタンパク質残基との間の共有結合が形成されることが観察された。したがって、この現象は、RNAおよびRBPの「ゼロ長」架橋と呼ばれている。これに続いて、厳格な精製手順少し背景^13、14とdure。

CLIPに相補的な戦略は、インビボ UV架橋とタンパク質同定とを組み合わせて RBPの景観を記述することである。そのようなゲノムワイドなmRNAの結合プロテオームの数は^、「のmRNAインタラクトームキャプチャ^」18と呼ばれるこの新規な実験的アプローチを用いて、酵母細胞、胚性幹細胞（ESC）、およびヒト細胞株（ 例えば、HEK293及びHeLa細胞）から単離されています^{19、20、21。}この方法は、インビボ UV架橋、続いてmRNP精製およびMSに基づくプロテオミクスからなる。この戦略を適用することによって、非カノニカルRBDを含む多くの新規の「月明かり」RBPが発見されており、以前よりも多くのタンパク質がRNA結合能力を有することが明らかになった「> ^{15、16、17は} 、この方法を使用することは、新しいアプリケーションやRBPsを調査する際、新たな生物学的な質問に答える能力が可能になります。例えば、最近の研究では、mRNA結合プロテオーム（コアRBPの保全を検討していますプロテオーム） ²² 。

プラントRBPsはすでに成長と開発に関与することが見出されている（ 例えば 、ミトコンドリアと葉緑体における開花時期の転写後調節、概日時計、および遺伝子発現に^{）24、25、26、27、28、29} 。さらに、それらは、非生物的ストレス（ 例えば、寒さ、干ばつ、sa）に応答する細胞プロセスにおいて機能を果たすと考えられているlinity、およびアブシジン酸^{（ABA））31、32、33、34。} RNA認識モチーフ（RRM）およびKホモロジー（KH）ドメイン配列モチーフに基づいて、 シロイヌナズナゲノム中に200を超える予測されたRBP遺伝子が存在する。イネにおいて、約250 ^35、36を注目されています。多くの予測されたRBPが、植物に独特であるようである（ 例えば、 RRMドメインを含む予測シロイヌナズナ RBPの約50％に対するメタアゾーンオーソログはない） ³⁵ 、これは多くが新しい機能を果たし得ることを示唆している。最も予測されたRBPの機能は特徴付けされていない²³ 。

シロイヌナズナ由来のmRNA結合プロテオームの単離は、苗木、葉組織、培養根細胞、および葉の葉肉プロトプラストを、mRNAインタラクトームキャプチャは最近^{、38、39に}報告されています。これらの研究は、近い将来植物における機能的RBPを体系的に分類する強力な可能性を実証している。ここで、我々は、植物プロトプラスト（ すなわち、細胞壁を有さない細胞）からのmRNA相互作用の捕獲のためのプロトコールを提示する。 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストは、葉の細胞の主要なタイプである。単離されたプロトプラストは、細胞へのUV光の最適なアクセスを可能にする。この細胞型は一過機能的特徴^40、41タンパク質を発現アッセイにおいて使用され得ます。また、プロトプラストは、いくつかの他の植物細胞型および種^42、43、44に印加されている（ 例えば、ピーターソンら 、2009; Bargmannとバーンバウム2010;および香港ら 、2012）。

<p class = "jove_content">このメソッドには合計11のステップが含まれています（ 図1A ）。 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストを最初に単離し（ステップ1）、次にUV照射して架橋したmRNPを形成する（ステップ2）。プロトプラストを変性条件下で溶解すると（ステップ3）、架橋されたmRNPは溶解/結合緩衝液中に放出され、オリゴd（T） ₂₅ビーズによって引き下げられる（ステップ4）。数回のストリンジェントな洗浄の後、mRNPを精製し、さらに分析する。 mRBPの変性ペプチドをプロテイナーゼKで消化してから、架橋したmRNAを精製し、RNA品質をqRT-PCR（ステップ5および6）によって確認する。 RNase処理およびタンパク質濃度（ステップ7）の後、タンパク質の品質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）および銀染色（ステップ8）によって制御される。タンパク質バンドパターンの違いは、架橋サンプル（CL）と非架橋サンプル（非CL;非架橋サンプル）との間で容易に視覚化することができる。UV照射を受けていないプロトプラストからの陰性対照試料）。タンパク質の同定は、MSに基づくプロテオミクスによって達成される。可能性のあるバックグラウンド汚染を除去するために、1次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（1D-PAGE）によってCLサンプルからのタンパク質を分離し、トリプシンを用いて短いペプチドに「ゲル内消化」し、精製する（工程9）。質量分析（ナノLC-MS）に結合されたナノ逆相液体クロマトグラフィーは、mRNA結合プロテオームにおける決定的なタンパク質の量の決定を可能にする（工程10）。最後に、同定されたmRBPを特徴付け、バイオインフォマティクス分析を用いてカタログ化する（ステップ11）。