Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Gli eukarioti utilizzano percorsi di regolazione della biogenesi multipla di RNA per mantenere i processi biologici cellulari. Tra i tipi noti di RNA, l'mRNA è molto diversificato e porta la capacità di codifica delle proteine ​​e delle loro isoforme. ^1. Il percorso PTGR indirizza le sorti dei pre-mRNA ^{2 , 3} . I RBP di diverse famiglie geniche controllano la regolazione dell'RNA, e in PTGR, mRBP specifici guidano mRNA attraverso interazioni fisiche dirette, formando mRNP funzionali. Di conseguenza, l'identificazione e la caratterizzazione dei mRBPs e dei loro mRNPs è fondamentale per la comprensione della regolazione del metabolismo cellulare mRNA ^2. Negli ultimi tre decenni, i vari metodi in vitro , inclusi i REMSA (REMSA), l'evoluzione sistematica dei ligandi mediante esami di arricchimento esponenziale (SELEX) basato su costruzioni derivate dalla biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcato o quantitativoI campioni di RNA di fluorescenza, la cristallografia a raggi X e la spettroscopia NMR ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} sono stati ampiamente applicati agli studi di RBP, principalmente da cellule di mammiferi. I risultati di questi studi su RBP mammiferi possono essere ricercati tramite la RNA-binding Protein DataBase (RBPDB), che raccoglie le osservazioni pubblicate ¹⁰ .

Anche se questi approcci in vitro sono strumenti potenti, determinano i motivi di RNA vincolati da un dato pool di sequenze di RNA e quindi sono limitate nella loro capacità di scoprire nuovi target RNA. Lo stesso vale per le strategie di calcolo per prevedere RBP a livello genomico, che si basano sulla conservazione della sequenza e della struttura proteica ¹⁵ . Per superare questo, un nuovo metodo sperimentale haÈ stato stabilito che consente l'identificazione dei motivi RNA che interviene un RBP di interesse, nonché per la determinazione della posizione precisa di legame. Questo metodo, chiamato "crosslinking e immunoprecipitazione" (CLIP), è composto da in-vivo reticolazione UV seguito da immunoprecipitazione ¹¹ . Studi iniziali hanno dimostrato che la fotoattivazione di nucleotidi di DNA e RNA può verificarsi a lunghezze d'onda UV di eccitazione maggiore di 245 nm. La reazione attraverso la timidina sembra essere favorita (rango in ordine di diminuzione della fotoreattività: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) ¹² . Utilizzando la luce UV con una lunghezza d'onda di 254 nm (UV-C), è stato osservato che i legami covalenti tra nucleotidi RNA e residui di proteine ​​sono creati quando nell'ambito di pochi Angstroms (Å). Il fenomeno è dunque chiamato "crosslinking" a zero lunghezza di RNA e RBP. Questo può essere seguito da una procedura di purificazione rigorosa Dura con poco sfondo ^{13 , 14} .

Una strategia complementare al CLIP è quella di combinare in vivo la reticolazione UV con l'identificazione delle proteine ​​per descrivere il paesaggio dei RBP. Un certo numero di tali proteomi legati al mRNA a livello genomico sono stati isolati da cellule staminali embrionali (ESCs) e linee cellulari umane ( cioè HEK293 e HeLa) utilizzando questo nuovo approccio sperimentale, chiamato "capture intercommunicazione mRNA" ^{18 , 19 , 20 , 21} . Il metodo è composto da in-vivo reticolazione UV seguita da purificazione mRNP e proteomica basata su MS. Applicando questa strategia, sono stati scoperti molti nuovi RBP "moonlighting" contenenti RBD non canonici, e è risultato chiaro che più proteine ​​hanno capacità di legame RNA rispetto a quanto precedentemente supposto"> 15 ^{, 16 , 17.} L'uso di questo metodo consente di nuove applicazioni e di capacità di rispondere a nuove domande biologiche durante l'analisi di RBP. Ad esempio, uno studio recente ha indagato sulla conservazione del proteome legato all'RNA (il nucleo RBP Proteome) tra il lievito e le cellule umane ²² .

I RBP vegetali sono già stati trovati coinvolti nella crescita e nello sviluppo ( ad esempio nella regolazione post-trascrizionale del tempo di fioritura, dell'orologio circadiano e dell'espressione genica in mitocondri e cloroplasti) ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29} . Inoltre, si pensa di svolgere funzioni nei processi cellulari che rispondono a sollecitazioni abiotiche ( ad esempio, freddo, siccità, sLinità e acido abscisico (ABA)) ^{31 , 32 , 33 , 34} . Ci sono più di 200 geni RBP previsti nel genoma Arabidopsis thaliana , basato su motivi di sequenza di dominio RNA (RRM) e K homology (KH); Nel riso, circa 250 sono stati notati ^{35 , 36} . È notevole che molti RBP previsti sembrano essere unici per le piante ( ad esempio, nessun ortologo metazoico a circa il 50% dei RBP di Arabidopsis previsti contenenti un dominio RRM) ³⁵ , suggerendo che molti potrebbero servire nuove funzioni. Le funzioni dei RBP più previste rimangono inarcabili ²³ .

L'isolamento dei proteomi legati al mRNA da Arabidopsis piantine etiolate, tessuti a foglia, cellule radicate coltivate e protoplasti di mezofosina di foglie attraverso l'uso diRecentemente è stata segnalata la cattura di interagenti mRNA ^{38 , 39} . Questi studi dimostrano il forte potenziale di catalogare sistematicamente i RBP funzionali nelle piante nel prossimo futuro. Qui presentiamo un protocollo per la cattura di intero mRNA da protoplasti vegetali ( cioè cellule senza pareti cellulari). I protoplasti di mezophyll delle foglie Arabidopsis thaliana sono il tipo principale di cellule di foglie. I protoplasti isolati consentono l'accesso ottimale della luce UV alle cellule. Questo tipo di cellula può essere utilizzato in saggi che esprimono transitoriamente proteine ​​per la caratterizzazione funzionale ^{40 , 41} . Inoltre, la protoplastica è stata applicata a diversi altri tipi di cellule vegetali e specie ^{42 , 43 , 44} ( es. Petersson et al ., 2009; Bargmann e Birnbaum, 2010; Hong et al ., 2012).

<P class = "jove_content"> Il metodo comprende un totale di 11 passaggi ( Figura 1A ). I protoplasti di mezophyll a foglia Arabidopsis vengono prima isolati (fase 1) e successivamente irradiati UV per formare mRNPs reticolati (fase 2). Quando i protoplasti vengono lisati in condizioni di denaturazione (fase 3), i mRNP reticolati vengono rilasciati in tampone di lisi / legame e tirati da oligo-d (T) ₂₅ brani (fase 4). Dopo diversi cicli di lavaggi rigorosi, i mRNPs vengono purificati e analizzati ulteriormente. I peptidi denaturati di mRBPs vengono digeriti mediante proteinasi K prima che i mRNA reticolati siano purificati e la qualità RNA è verificata da qRT-PCR (passaggi 5 e 6). Dopo la terapia con RNase e la concentrazione di proteine ​​(fase 7), la qualità della proteina è controllata mediante elettroforesi in poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) e colorazione in argento (fase 8). La differenza di pattern di banda proteica può essere facilmente visualizzata tra un campione reticolato (CL) e un campione non reticolato (non CL;Il campione di controllo negativo da protoplasti che non è sottoposto ad irraggiamento UV). L'identificazione delle proteine ​​è ottenuta tramite proteomica basata su MS. Le proteine ​​del campione CL sono separate da un'elettroforesi a gel di poliacrilammide (1D-PAGE) unidimensionale per rimuovere eventuali contaminazioni di fondo, sono "in-gel digerite" in peptidi corti utilizzando la tripsina e vengono purificati (fase 9). La cromatografia liquida a fase inversa di fase nano accoppiata alla spettrometria di massa (nano-LC-MS) permette di determinare la quantità di proteine ​​definitive nel proteome legato al mRNA (fase 10). Infine, i mRBP identificati sono caratterizzati e catalogati utilizzando analisi bioinformatica (fase 11).