Capture interactine d'ARNm à partir de protoplastes végétaux

Les eucaryotes utilisent plusieurs voies de régulation de la biogenèse de l'ARN pour maintenir les processus biologiques cellulaires. Parmi les types connus d'ARN, l'ARNm est très diversifié et porte la capacité de codage des protéines et leurs isoformes ^1. La voie PTGR dirige le sort des pré-ARNm ^{2 , 3} . Les RBP de différentes familles de gènes contrôlent la régulation de l'ARN, et dans PTGR, les mRBP spécifiques guident les ARNm par des interactions physiques directes, formant des mRNP fonctionnels. Par conséquent, l'identification et la caractérisation des mRBP et de leurs mRNP sont essentiels pour comprendre la régulation du métabolisme de l'ARNm cellulaire ^2. Au cours des trois dernières décennies, diverses méthodes in vitro – y compris les tests de changement de mobilité électrophorétique de l'ARN (REMSA), l'évolution systématique des ligands par des essais d'enrichissement exponentiel (SELEX) basé sur des constructions dérivées de bibliothèque, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarquées ou quantitativesLes essais de liaison à l'ARN de fluorescence, la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} – ont été largement appliqués aux études de RBP, principalement à partir de cellules de mammifères. Les résultats de ces études sur les RBP de mammifères peuvent être recherchés via la base de protéines de liaison à l'ARN (RBPDB), qui collecte les observations publiées ¹⁰ .

Bien que ces approches in vitro soient des outils puissants, elles déterminent les motifs d'ARN liés à partir d'un groupe d'ARN donné de séquences et sont donc limitées dans leur capacité à découvrir de nouveaux ARN cible. Il en va de même pour les stratégies informatiques pour prédire les RBP à l'échelle du génome, qui sont basées sur la conservation de la séquence et de la structure des protéines ¹⁵ . Pour remédier à cela, une nouvelle méthode expérimentale haA été établi qui permet d'identifier les motifs d'ARN auxquels une RBP d'intérêt interagit, ainsi que pour déterminer l'emplacement précis de la liaison. Cette méthode, appelée «réticulation et immunoprécipitation» (CLIP), est composée d'une réticulation UV in vivo suivie d'une immunoprécipitation ¹¹ . Les premières études ont montré que la photoactivation des nucléotides d'ADN et d'ARN peut se produire à des longueurs d'onde UV d'excitation supérieures à 245 nm. La réaction à travers la thymidine semble être favorisée (classement par ordre de diminution de la photoréactivité: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) ¹² . En utilisant une lumière UV avec une longueur d'onde de 254 nm (UV-C), on a observé que des liaisons covalentes entre des nucléotides d'ARN et des résidus de protéines sont créées dans la gamme de seulement quelques Angstroms (Å). Le phénomène est donc appelé la réticulation "nulle" de l'ARN et du RBP. Ceci peut être suivi d'une procédure de purification rigoureuse Dure peu de fond ^{13 , 14} .

Une stratégie complémentaire de CLIP consiste à combiner la réticulation UV in vivo avec l'identification des protéines pour décrire le paysage des RBP. Un certain nombre de protéome tels lié ARNm-pangénomiques ont été isolées à partir de cellules de levure, les cellules souches embryonnaires (CSE), et des lignées cellulaires humaines (c. -à- HEK293 et HeLa) en utilisant cette nouvelle approche expérimentale, appelée « ARNm interactome capture » ^{18, 19 , 20 , 21} . Le procédé est composé d'une réticulation UV in vivo suivie d'une purification de mRNP et d'une protéomique à base de MS. En appliquant cette stratégie, on a découvert de nombreuses RBP romantiques "Moonlighting" contenant des RBD non canoniques, et il est devenu évident que plus de protéines ont des capacités de liaison à l'ARN que précédemment supposées"> 15 ^{, 16 , 17.} L'utilisation de cette méthode permet de nouvelles applications et la capacité de répondre à de nouvelles questions biologiques lors de l'étude des RBP. Par exemple, une étude récente a étudié la conservation du protéome lié à l'ARNm (RBP de base Protéome) entre la levure et les cellules humaines ²² .

Les RBP des plantes ont déjà été impliquées dans la croissance et le développement ( p . Ex ., Dans la régulation post-transcriptionnelle du temps de floraison, de l'horloge circadienne et de l'expression des gènes dans les mitochondries et les chloroplastes) ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29} . En outre, on pense qu'ils exercent des fonctions dans les processus cellulaires répondant aux contraintes abiotiques ( p. Ex., Froid, sécheresse, saLinity et abscisic acid (ABA)) ^{31 , 32 , 33 , 34} . Il existe plus de 200 gènes de RBP prédits dans le génome d' Arabidopsis thaliana , basés sur des motifs de séquence de domaine de reconnaissance d'ARN (RRM) et de K (HK) d'homologie (KH); Dans le riz, environ 250 ont été notés ^{35 , 36} . Il est remarquable que de nombreuses RBP prédites semblent être uniques aux plantes ( p. Ex., Aucun orthologue métazoaire à environ 50% des RBP d' Arabidopsis prédites contenant un domaine RRM) ³⁵ , suggérant que beaucoup peuvent servir de nouvelles fonctions. Les fonctions de la plupart des RBP prédites restent non caractérisées ²³ .

L'isolement des protéomes liés à l'ARNm provenant des semis étiolés d' Arabidopsis , des tissus foliaires, des cellules racines cultivées et des protoplastes de mésophylle foliaire par l'utilisation deLa capture de l'interaction de l'ARNm a récemment été rapportée ^{38 , 39} . Ces études démontrent le fort potentiel de catalogage systématique de RBP fonctionnelles dans les plantes dans un proche avenir. Ici, nous présentons un protocole pour la capture de l'interaction de l'ARNm à partir de protoplastes végétaux ( c.-à-d. Cellules sans parois cellulaires). Les protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana sont le principal type de cellule foliaire. Les protoplastes isolés permettent un accès optimal de la lumière UV aux cellules. Ce type de cellule peut être utilisé dans des analyses qui expriment de manière transitoire des protéines pour la caractérisation fonctionnelle ^{40 , 41} . En outre, le protoplage a été appliqué à plusieurs autres types de cellules végétales et aux espèces ^{42 , 43 , 44} ( p. Ex., Petersson et al ., 2009; Bargmann et Birnbaum, 2010; et Hong et al ., 2012).

<P class = "jove_content"> La méthode englobe un total de 11 étapes ( Figure 1A ). Les protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis sont d'abord isolés (étape 1) et sont par la suite irradiés par UV pour former des mRNP réticulés (étape 2). Lorsque les protoplastes sont lysés dans des conditions de dénaturation (étape 3), les mRNP réticulés sont libérés dans un tampon de lyse / liaison et abattus par des billes oligo-d (T) ₂₅ (étape 4). Après plusieurs cycles de lavages rigoureux, les mRNP sont purifiés et analysés plus avant. Les peptides dénaturés des mRBP sont digérés par la protéinase K avant que les ARNm réticulés ne soient purifiés et que la qualité de l'ARN soit vérifiée par qRT-PCR (étapes 5 et 6). Après le traitement par RNase et la concentration de protéines (étape 7), la qualité de la protéine est contrôlée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) et coloration à l'argent (étape 8). La différence entre les bandes de protéines peut facilement être visualisée entre un échantillon réticulé (CL) et un échantillon non réticulé (non CL;L'échantillon témoin négatif des protoplastes qui n'est pas soumis à une irradiation UV). L'identification des protéines est obtenue grâce à une protéomique à base de MS. Les protéines provenant de l'échantillon CL sont séparées par une électrophorèse en gel de polyacrylamide unidimensionnel (1D-PAGE) pour éliminer la contamination potentielle du fond, sont "digérées dans un gel" en peptides courts en utilisant de la trypsine et sont purifiées (étape 9). La chromatographie liquide à phase inverse nano couplée à la spectrométrie de masse (nano-LC-MS) permet de déterminer la quantité de protéines définitives dans le protéome lié à l'ARNm (étape 10). Enfin, les mRBP identifiés sont caractérisés et catalogués à l'aide d'une analyse bioinformatique (étape 11).