JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

Published: July 28, 2017
doi:
10.3791/56011
, , ,
1Department of Biology,KU Leuven

Summary

هنا، نقدم بروتوكول الالتقاط إنتيراكتوم تطبيقها على أرابيدوبسيس ثاليانا أوراق ميسوفيل ورقة بروتوبلاستس. هذه الطريقة تعتمد بشكل حاسم على في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابك ويسمح لعزل وتحديد البروتينات مرنا مرتبط النبات من بيئة فسيولوجية.

Abstract

البروتينات ملزمة رنا (ربس) تحديد مصائر رنا. وهم يشاركون في جميع مسارات بيوانيسيس الحمض النووي الريبي ويساهم بشكل خاص في تنظيم الجينات بعد النسخي (بتغر) من رنا رسول (مرناس). في السنوات القليلة الماضية، تم عزل عدد من بروتيوم مرنا ملزمة من الخميرة وخلايا الثدييات خطوط بنجاح من خلال استخدام طريقة جديدة تسمى "مرنا التقاط إنتيراكتوم"، والذي يسمح لتحديد البروتينات مرنا ملزمة (مربس) مباشرة من بيئة فسيولوجية. وتتكون هذه الطريقة من في الجسم الحي فوق البنفسجية (أوف) يشابك، سحب إلى أسفل وتنقية المجمعات ريبونوكلوبروتين رسول (مرنبس) من قبل حبات صغيرة (دت)، وتحديد اللاحقة للبروتينات كروسلينكد بواسطة مطياف الكتلة (مس). في الآونة الأخيرة، من خلال تطبيق نفس الطريقة، وقد تم الإبلاغ عن العديد من النباتات مرنا مرتبط بروتيوم في وقت واحد من مختلف مصادر الأنسجة أرابيدوبسيس : شتلات عتيقة،أوراق بروتينات الميزوفيل الورقية، والخلايا الجذرية المستزرعة. هنا، نقدم الأمثل مرنا طريقة التفاعل إنتيراكوموم ل أرابيدوبسيس ثاليانا أوراق بروتوبلاستس ميسوفيل ورقة، وهو نوع الخلية التي تعمل كأداة تنوعا للتجارب التي تشمل المقايسات الخلوية المختلفة. الشروط للحصول على أفضل محصول البروتين تشمل كمية من الأنسجة بدءا ومدة أشعة فوق البنفسجية. في بروتيوم مرنا ملزمة التي تم الحصول عليها من تجربة متوسطة النطاق (10 7 خلايا)، لاحظت ربس أن تم العثور على قدرة ملزم رنا أن تكون ممثلة تمثيلا زائدا، وتم تحديد العديد من الممارسات التجارية التقييدية الجديدة. ويمكن توسيع نطاق التجربة (10 9 خلايا)، ويمكن تطبيق الطريقة المثلى على أنواع الخلايا النباتية الأخرى والأنواع لعزل واسع، الكتالوج، ومقارنة بروتيوم مرنا المرتبطة في النباتات.

Introduction

تستخدم اليوكاريوتس مسارات تنظيمية متعددة ل رنا بيوجينيسيس للحفاظ على العمليات البيولوجية الخلوية. من بين الأنواع المعروفة من الحمض النووي الريبي، مرنا متنوعة جدا ويحمل القدرة على الترميز من البروتينات و إسوفورمز 1 .The بتغر مسار يوجه مصير ما قبل مرناس 2 ، 3 . الممارسات التجارية التقييدية من مختلف الأسر الجينات السيطرة على تنظيم الحمض النووي الريبي، وفي بتغر، مربس محددة دليل مرناس من خلال التفاعلات المادية المباشرة، تشكيل مرنبس وظيفية. لذلك، تحديد و مربس وصفها و مرنبس أمر بالغ الأهمية لفهم تنظيم استقلاب مرنا الخلوي 2. على مدى العقود الثلاثة الماضية، ومختلف في الطرق المختبرية – بما في ذلك الحمض النووي الريبي التحولات التحول (ريمزا) المقايسات، والتطور المنهجي للروابط بواسطة المقايسات الإثراء الأسي (سيليكس) استنادا إلى البنى المستمدة من المكتبة، رنا بيند-n-سيق (ربنز)، راديولبلد أو الكميةومضامين ملزمة الحمض النووي الريبي مضان، والبلورات بالأشعة السينية، وطيفي الرنين المغناطيسي النووي 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 – تم تطبيقها على نطاق واسع لدراسات الممارسات التجارية التقييدية، وذلك أساسا من خلايا الثدييات. ويمكن البحث عن نتائج هذه الدراسات من الممارسات التجارية التقييدية الثدييات عن طريق قاعدة بيانات البروتين ملزم رنا (رببدب)، الذي يجمع الملاحظات المنشورة 10 .

على الرغم من أن هذه النهج في المختبر هي أدوات قوية، فإنها تحدد الحواف الحمض النووي الريبي ملزمة من تجمع الحمض النووي الريبي معين من تسلسل، وبالتالي فهي محدودة في قدرتها على اكتشاف رنا المستهدفة الجديدة. وينطبق الشيء نفسه على الاستراتيجيات الحسابية للتنبؤ بالممارسات التجارية التقييدية على نطاق الجينوم، والتي تقوم على حفظ تسلسل البروتين والبنية 15 . للتغلب على هذا، طريقة تجريبية جديدة هاتم تأسيسها التي تسمح لتحديد زخارف الحمض النووي الريبي أن تتفاعل ربب الفائدة مع، وكذلك لتحديد الموقع الدقيق للالتزام. هذه الطريقة، ودعا "يشابك ومناعي" (كليب)، ويتألف من في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابها تليها مناعي 11 . وقد أظهرت الدراسات المبكرة أن فوتواكتيفاتيون من الحمض النووي والنيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي يمكن أن تحدث في موجات الأشعة فوق البنفسجية الإثارة أكبر من 245 نانومتر. التفاعل من خلال ثيميدين يبدو أن يفضل (رتبة في الترتيب من انخفاض النشاط الضوئي: دت ≥ دك> رو> رك، دا، دغ) 12 . باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع طول موجة من 254 نانومتر (أوف-C)، لوحظ أن الروابط التساهمية بين النيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي ومخلفات البروتين يتم إنشاؤها عندما يكون في مجموعة من عدد قليل من أنغسترومز (Å). وبالتالي تسمى هذه الظاهرة "الصفر طول" تشابك رنا و ربب. هذا يمكن أن يتبعها بروسيس التنقية الصارمة ديور ويث ليتل باكغروند 13 ، 14 .

وهناك استراتيجية مكملة ل كليب هو الجمع بين في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابك مع تحديد البروتين لوصف المشهد من الممارسات التجارية التقييدية. وقد تم عزل عدد من هذه البروتينات المرتبطة مرنا الجينوم على نطاق واسع من خلايا الخميرة والخلايا الجذعية الجنينية (إيسس)، وخلايا الخلايا البشرية ( أي HEK293 و هيلا) باستخدام هذا النهج التجريبي الرواية، ودعا "مرنا إنتيراكتوم التقاط" 18 ، 19 ، 20 ، 21 . وتتكون هذه الطريقة من في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابها تليها تنقية مرنب والبروتيوميات المستندة إلى مس. من خلال تطبيق هذه الاستراتيجية، تم اكتشاف العديد من رواية "مونلايتينغ" ربس التي تحتوي على ربد غير متعارف عليها، وأصبح من الواضح أن المزيد من البروتينات لديها قدرات ملزمة رنا مما كان مفترضا سابقا"> 15 ، 16 ، 17. استخدام هذا الأسلوب يسمح للتطبيقات الجديدة والقدرة على الإجابة على الأسئلة البيولوجية الجديدة عند التحقيق الممارسات التجارية على سبيل المثال، على سبيل المثال، وقد بحثت دراسة حديثة لحفظ بروتيوم مرنا ملزمة (ربب الأساسية بروتيوم) بين الخميرة والخلايا البشرية 22 .

وقد وجد بالفعل أن الممارسات التجارية التقييدية النباتية تشارك في النمو والتنمية (على سبيل المثال ، في التنظيم اللاحق للوقت المزهر، والساعة البيولوجية، والتعبير الجيني في الميتوكوندريا والبلاستيك) 24 و 25 و 26 و 27 و 28 و 29 . وعلاوة على ذلك، يعتقد أنها تؤدي وظائف في العمليات الخلوية التي تستجيب للإجهاد اللاأحيائي (على سبيل المثال، البرد، الجفاف، سالينيتي، و أبسيسيك أسيد (أبا)) 31 ، 32 ، 33 ، 34 . هناك أكثر من 200 الجينات ربب المتوقع في الجينوم أرابيدوبسيس ثاليانا ، استنادا إلى رنا الاعتراف عزر (رم) و K التماثل (خ) تسلسل مجال المجال. في الأرز، لوحظ ما يقرب من 250 ، 35 ، 36 . ومن الجدير بالذكر أن العديد من التنبؤات المحتوية على البروتينات تبدو فريدة من نوعها للنباتات (على سبيل المثال، لا أورثولوغ ميتازوان إلى ما يقرب من 50٪ من اربيدوبسيس تنبؤات ربس التي تحتوي على مجال رم) 35 ، مما يشير إلى أن العديد قد تخدم وظائف جديدة. ولا تزال وظائف معظم الممارسات التجارية التقييدية المتوقعة غير معهودة 23 .

عزل بروتيوم مرنا المرتبطة من شتلات أرابيدوبسيس أتيولاتد، الأنسجة ورقة، الخلايا الجذرية مثقف، و بروتوبلاستس ورقة ميسوفيل من خلال استخداموقد تم الإبلاغ عن مرنا تفاعلية التقاط مؤخرا 38 ، 39 . وتدل هذه الدراسات على الإمكانية القوية للفهرسة المنهجية للممارسات التجارية التقييدية الوظيفية في النباتات في المستقبل القريب. هنا، نقدم بروتوكول لالتقاط مرنا التفاعلي من بروتوبلاستس النبات ( أي الخلايا دون جدران الخلايا). أرابيدوبسيس ثاليانا ليفس ميسوفيل بروتوبلاستس هي النوع الرئيسي من الخلايا الورقية. بروتوبلاستس معزولة تسمح الوصول الأمثل للضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى الخلايا. ويمكن استخدام هذا النوع من الخلايا في المقايسات التي تعبر عن عابرة البروتينات لتوصيف وظيفي 40 ، 41 . وعلاوة على ذلك، تم تطبيق بروتوبلاستينغ على العديد من أنواع الخلايا النباتية الأخرى والأنواع 42 ، 43 ، 44 (على سبيل المثال، بيترسون وآخرون ، 2009؛ بارغمان وبيرنبوم، 2010؛ وهونغ وآخرون ، 2012).

<p كلاس = "jove_content"> تتضمن الطريقة ما مجموعه 11 خطوة ( الشكل 1A ). أرابيدوبسيس أوراق بروتوبلاستس ميسوفيل معزولة أولا (الخطوة 1)، وبالتالي الأشعة فوق البنفسجية المشع لتشكيل مرنبس كروسلينكد (الخطوة 2). عندما يتم تحلل بروتوبلاستس تحت ظروف تغيير طبيعة (الخطوة 3)، يتم الافراج عن مرنبس كروسلينكد في تحلل / العازلة ملزمة وسحبت من قبل أوليغو د (T) 25 الخرز (الخطوة 4). بعد عدة جولات من يغسل صارمة، يتم تنقية مرنبس وتحليلها. يتم هضم الببتيدات التشويه والتحريف من مربس بواسطة بروتين K قبل تنقية مرناس كروسلينكد ويتم التحقق من جودة الحمض النووي الريبي بواسطة كرت-ير (الخطوات 5 و 6). بعد العلاج ريبونوكلياز وتركيز البروتين (الخطوة 7)، يتم التحكم في جودة البروتين بواسطة سدز بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (سدز-بادج) والفضة تلطيخ (الخطوة 8). الفرق في أنماط الفرقة البروتين يمكن بسهولة أن تصور بين عينة كروسلينكد (كل) وعينة غير كروسلينكد (غير كل؛عينة السيطرة السلبية من بروتوبلاستس التي لا تتعرض للأشعة فوق البنفسجية التشعيع). ويتحقق تحديد البروتينات من خلال البروتيوميات التي تستند إلى مس. يتم فصل البروتينات من عينة كل من هلام بولي أكريلاميد الكهربائي واحد الأبعاد (1D-بادج) لإزالة التلوث الخلفية المحتملة، هي "في هلام هضمها" إلى الببتيدات قصيرة باستخدام التربسين، وتنقيتها (الخطوة 9). نانو عكس المرحلة اللوني السائل إلى جانب مطياف الكتلة (نانو-لك-مس) يسمح لتحديد كمية من البروتينات نهائية في بروتيوم مرنا ملزمة (الخطوة 10). وأخيرا، يتم وصف المربس المحددة وفهرسة باستخدام التحليل المعلوماتية الحيوية (الخطوة 11).

Protocol

1. أرابيدوبسيس ليف ميسوفيل بروتوبلاست العزلة ملاحظة: بروتوبلاستس نبات أرابيدوبسيس ميسوفيل معزولة أساسا كما وصفها يو وآخرون ، 2007، مع العديد من التعديلات 40 . <li style=";text-align:right;directi…

Representative Results

لاحظنا هالة مميزة، الذي يحيط بيليه حبة في العينة كل، في غسل الخطوة 4.3 مع غسل العازلة 2 ( الشكل 1B ). على الرغم من أنه لم يتم التحقيق، ويمكن تفسير هذه الظاهرة ربما من خلال تدخل المجمعات مرنب كروسلينكد مع حبة التجميع خلال التقاط المغناطيسي…

Discussion

طبقنا بنجاح مرنا التقاط إنتيراكتوم، وضعت للخميرة والخلايا البشرية، لزراعة بروتوبلاستس ميسوفيل ورقة. خلايا ميسوفيل ليف هي النوع الرئيسي من الأنسجة الأرضية في أوراق النبات. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يستخدم في الجسم الحي كروسلينكينغ لاكتشاف البروتينا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نعترف مختبر البروفيسور جوريس ويندريككس، الذي قدم الأشعة فوق البنفسجية جهاز يشابك مجهزة مصباح الأشعة فوق البنفسجية التقليدية. ويدعم كغ من قبل صندوق أبحاث جامعة ليوفن ويوافق على الدعم من منحة فو G065713N.

Materials

REAGENTS
0.8 M Mannitol Sigma M1902-500G Primary isotonic Enzyme solution &
MMg solution
2M KCl MERCK Art. 4935 Primary isotonic Enzyme solution &
W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-morpholineethanesulfonic acid)		 Sigma-aldrich M2933 Primary isotonic Enzyme solution,
W5 buffer &
MMg solution,
Filtration sterilization
Cellulase R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. CELLULASE
“ONOZUKA”
R-10, 10 g		 Final isotonic enzyme solution
Macerozyme R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. MACEROZYME R-10, 10g Final isotonic enzyme solution
10% (w/v) BSA
(Bovine Serum Albumin)		 Sigma-aldrich A7906-100G Final isotonic enzyme solution &
Filtration sterilization
1M CaCl2 Chem-Lab NV CL00.0317.1000 Final isotonic enzyme solution,
W5 buffer &
Digestion buffer
1M NaCl Fisher Chemical S/3160/60 W5 buffer
2M MgCl2 Sigma M8266-100G MMg solution
1M LiCl
(Lithium Chloride)		 Acros 199885000 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2 &
Low salt buffer
5% (w/v) LiDS
(Lithium Dodecyl Sulphate)		 Sigma-aldrich L4632-25G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1 &
Filtration sterilization
1M DTT
(Dithiothreitol)		 Thermo Fisher Scientific
Wash buffer 1 &
Wash buffer 2		 307866 Lysis/binding buffer,
1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) Acros &
Fisher Chemical		 167620010 &
H/1200/PB15		 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-aldrich ED-500G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
Tween 20 MERCK 8.22184.0500 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
0.1 M NaOH VWR PROLABO CHEMICALS 28244.295 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
1X PBS (pH 7.4)
(Phosphate Buffered Saline)
containing
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)		 Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		 S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
Proteinase K solution (2 μg/μL) Thermo Fisher Scientific 11789020 Protein digestion
Loading dye Invitrogen LC5925 SDS-PAGE
qPCR master mix Promega A6001 qRT-PCR assay
RNase Cocktail Thermo Fisher Scientific AM2286 RNA digestion
Methanol Sigma-aldrich 322415 Gel fixation and gel destaining
Acetic acid Sigma-aldrich 537020 Gel fixation and gel destaining
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Fisher Scientific 20278 Gel staining
1M NH4HCO3
(Ammonium bicarbonate)
 		 Sigma-aldrich 09830-500G Gel hydration &
Digestion buffer
CH3CN
(Acetonitrile)		 Sigma-aldrich 34851-100ML Gel dehydration &
Peptide dissolving solution
IAA
(Iodoacetic acid)		 Sigma-aldrich I4386-10G Alkylating agent
TFA
(Trifluoroacetic acid)		 Sigma-aldrich 302031-10X1ML Peptide dissolving solution
FA
(Formic acid)		 Sigma-aldrich 06554-5G Peptide extraction
Trypsin solution (6 ng/μL) Promega V5280 Digestion buffer
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Soil Peltracom LP2D Plant growth
Vermiculite 3 Sibli AS 05VERMICULIET Plant growth
Petri dish (150 x 20 mm) Sarstedt 82.1184.500 Carrier for protoplast suspension
0.22 μm filter Millipore SE2M229104 Homogenization of final isotonic enzyme solution
Razorblade Agar Scientific T585 Rosette leaf strips
35-75 μm nylon mesh SEFAR NITEX 74010 Protoplast suspension filtration
50 mL round bottom tubes Sigma-aldrich T1918-10EA Carrier for protoplast suspension
Hemocytometer
(Bürker hemocytometer)		 MARIENFELD 650030 Protoplast cell counting
UV crosslinking apparatus
(HL-2000 HybriLinker)		 UVP, LLC UVP95003101 in vivo UV crosslinking
UV lamp
(Sankyo-Denki G8T5)		 SANKYO
DENKI		 SD G8T5 in vivo UV crosslinking
50 mL glass syringe FORTUNA Optima Z314560 Homogenization of protoplast lysate
Narrow needle (0.9 x 25 mm) Becton Dickinson microlance 3 2021-04 Homogenization of protoplast lysate
Rotator Model L26 Labinco BV 26110912 Sample incubation by rotating
Oligo-d(T)25 magnetic beads
(5 mg/mL)		 New England BioLabs S1419S mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Magnetic rack Invitrogen CS15000 mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Centrifugal filter units
(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)		 EMD Millipore UFC800308 mRBP concentration
Pierce Silver Stain Kit Thermo Fisher Scientific 24612 Silver-staining assay
RNA purification kit
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)		 STRATEC Molecular 1064100300 RNA purification
Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific ND-1000 RNA quality and quantity
Real-Time PCR cycler
(StepOne Real-Time PCR cycler)		 Thermo Fisher Scientific 4376600 cDNA quantification
µ-C18 columns
(Millipore Zip Tip µ-C18 columns)		 Sigma-aldrich 720046-960EA Peptide purification
Mass spectrometer
(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)		 Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR Mass spectrometry-based proteomics
Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) Thermo Fisher Scientific ULTIM3000RSLCNANO Mass spectrometry-based proteomics
C18 column
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)		 Thermo Fisher Scientific ES800 Mass spectrometry-based proteomics
C18 precolumn
(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)		 Thermo Fisher Scientific 160321 Mass spectrometry-based proteomics
Name Company Catalog Number Comments
Primers for qRT-PCR assay Sequences
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		 Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		 Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
  2. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  3. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
  4. Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
  5. Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
  6. Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
  7. Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
  8. Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
  9. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  10. Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, D301-D308 (2011).
  11. Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
  12. Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
  13. Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
  14. Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
  15. Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
  16. Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
  17. Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
  18. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  19. Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  20. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  21. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 127-133 (2013).
  22. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
  23. Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
  24. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
  25. Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
  26. Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
  27. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annu Rev Plant Biol. 61, 125-155 (2010).
  28. Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986 (2013).
  29. Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
  30. Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
  31. Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
  32. Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
  33. Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
  34. Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
  35. Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
  36. Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
  37. Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
  38. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
  39. Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  40. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  41. Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
  42. Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
  43. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
  44. Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
  45. Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
  46. Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
  47. Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
  48. Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
  49. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587 (2012).
  50. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
  51. Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
  52. Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
  53. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
  54. Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
  55. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).

Tags

MRNA InteractomeMRNA-bound ProteomePlant ProtoplastsPost-transcriptional Gene RegulationUV CrosslinkingArabidopsis ThalianaLeaf Mesophyll ProtoplastsMMG SolutionCentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Z., Boonen, K., Li, M., Geuten, K. mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts. J. Vis. Exp. (125), e56011, doi:10.3791/56011 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image