Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre
Summary
Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.
Abstract
Terapias baseadas em células autólogas tem um passo mais próximo da realidade com a introdução de células-tronco pluripotentes induzidas. Células-tronco fetais, tais como o líquido amniótico e membrana células-tronco mesenquimais, representam um único tipo de células indiferenciadas com promessa em engenharia de tecidos e para reprogramação para iPSC para futuras intervenções pediátricas e células-tronco bancário. O protocolo aqui apresentado descreve um processo otimizado para a extração e cultivo primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco e gerando epissomal induzida por células-tronco pluripotentes dessas células em cultura totalmente quimicamente definida condições utilizando vitronectina recombinante humana e o meio de E8. Caracterização das novas linhas através da aplicação de métodos rigorosos – citometria de fluxo, imagem latente confocal, formação de teratoma e criação de perfil transcricional – também é descrita. As linhas recém-gerado expressam marcadores de células-tronco embrionárias – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – Apesar de ser negativa para o marcador SSEA-1. As linhas de células-tronco formam os teratomas em camundongos scid-bege em 6-8 semanas e os teratomas contêm tecidos representativos de todas as três camadas germinativas. Perfil transcricional das linhas através da apresentação de dados de microarray de expressão global para um algoritmo de avaliação de pluripotência bioinformatic considera-se todas as linhas pluripotentes e, portanto, esta abordagem é uma alternativa atraente à experimentação animal. As novas linhas de iPSC prontamente podem ser usadas em experimentos a jusante, envolvendo a otimização da diferenciação e da engenharia de tecidos.
Introduction
A tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) traz sobre potenciais terapias de substituição de células, doença e modelagem do desenvolvimento e drogas e triagem toxicológica1,2,3. Terapias de substituição conceitualmente pode ser alcançadas por injeção de célula, in vitro diferenciadas implantação de tecido (como patches cardíacas), ou guiada de regeneração por meio da engenharia de tecidos. O líquido amniótico (AFSC) e células-tronco da membrana (AMSC) também são uma excelente fonte de células para estas intervenções diretamente4,5,6,7 ou como uma população inicial de célula para reprogramação em pluripotência8,9,10,11,12.
Abordagens iniciais utilizados sistemas de cultura indefinido ou reprogramação métodos que exigem integração genômica de sucessão legal de constrói9,10,11,12. Um estudo mais recente empregado um meio livre de xeno, apesar de uma matriz de acessório de membrana basal menos definida (BMM) foi usada, para gerar iPSC de células epiteliais de líquido amniótico. No entanto, o ensaio de formação de teratoma não foi incluído no estudo junto com uma riqueza de dados moleculares e in vitro. Células epiteliais de líquido amniótico foram encontradas para ter um rendimento aproximadamente 8 vezes maior reprogramação quando comparado aos fibroblastos neonatais13. Em outro estudo, células-tronco mesenquimais do líquido amniótico também foram encontradas para ser reprogramado para iPSC com muita eficiência maior12.
Células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em representante de tecidos de todas as 3 camadas do germe e, portanto, têm o potencial mais amplo. Pacientes pediátricos poderiam beneficiar a colheita, reprogramação e engenharia de tecidos de suas células-tronco autólogas amnióticos fluidas pré-natal e haste de membrana amniótica células perinatal. Além disso, o nível relativamente baixo de diferenciação de células-tronco fetais (menores que as células estaminais adultas14,15) poderia teoricamente ajuda na abordando a observada retenção de viés epigenéticas de células de origem em iPSC16.
Aqui nós apresentamos um protocolo para reprogramação de líquido amniótico e membrana células-tronco de pluripotência em quimicamente definidos xeno-free E8 médio na recombinação vitronectina17 (VTN) usando plasmídeos epissomal18. A principal vantagem das células líquido e membrana amnióticos como fonte de células para reprogramação reside na sua disponibilidade pré e perinatal e, portanto, esta abordagem beneficiaria principalmente pesquisa em engenharia de tecidos pediátrica.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fase inicial de geração de iPSC de células estaminais fetais implica a extração de células de origem de tecidos fetais, sua cultura, expansão e introdução dos Plasmideos reprogramação epissomal. Esta fase é seguida de um período de cultura de cerca de 14-18 dias antes das primeiras colônias totalmente reprogramadas podem ser expandidas. A fase final é a maturação dos clones iPSC. A extração inicial de células-tronco membrana amniótica é conseguida por meio de uma digestão mecânica e enzimática …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Fonds Medizinische pesquisa na Universidade de Zurique, Forschungskredit da Universidade de Zurique, o NMS SCIEXCh sob bolsas 10.216 e 12.176, a sociedade Suíça de Cardiologia, a ciência nacional suíço Fundação sob concessão [320030-122273] e [310030-143992], o 7º programa-quadro, a válvula de vida, a Comissão Europeia sob concessão [242008], a Olga Mayenfisch Foundation, Fundação EMDO, a concessão de start-up 2012 do Hospital da Universidade de Zurique, e financiamento interno do Instituto de câncer de Mitchell.
Materials
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette – transfection pipette Neon device – transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip – transfection tip Neon tube – transfection tube buffer R – resuspension buffer buffer E – electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
References
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