Reprogrammation du liquide amniotique primaire et cellules de Membrane de pluripotence dans des Conditions sans Xeno
Summary
Ce protocole décrit la reprogrammation des primaires amniotique fluide et membrane de cellules souches mésenchymateuses sur les cellules souches pluripotentes induites en utilisant une approche épisomiques sans intégration dans des conditions totalement chimiquement définies. Les procédures d’extraction, la culture, la reprogrammation et la caractérisation des cellules souches pluripotentes induites qui en résulte par une méthodologie rigoureuse sont reprises.
Abstract
Thérapies à base cellulaire autologues obtenu un pas de plus vers la réalité avec l’introduction de cellules souches pluripotentes induites. Les cellules souches fœtales, tels que le liquide amniotique et la membrane des cellules souches mésenchymateuses, représentent un type unique de cellules non différenciées avec promesse en génie tissulaire et de reprogrammation en iPSC pour futures interventions pédiatriques et cellules souches bancaire. Le protocole présenté ici décrit une méthode optimisée pour l’extraction et la mise en culture primaire amniotique fluide et membrane de cellules souches mésenchymateuses et générant épisomiques induite par les cellules souches pluripotentes de ces cellules en culture entièrement chimiquement définie conditions utilisant la vitronectine recombinante humaine et le milieu E8. Caractérisation des nouvelles lignes en appliquant des méthodes rigoureuses – cytométrie en flux, imagerie confocale, formation de tératome et profilage transcriptionnel – est également décrite. Les lignes nouvellement générés expriment des marqueurs de cellules souches embryonnaires – Oct3/4 a, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – tout en étant négatif pour le marqueur SSEA-1. Les lignées de cellules souches forment des tératomes chez la souris scid-beige dans 6 à 8 semaines et les tératomes contiennent des tissus représentatifs de tous les trois couches de germe. Profilage transcriptionnel des lignes par envoi de données microarray expression globale à un algorithme d’évaluation de pluripotence bioinformatic réputé toutes les lignes pluripotentes et par conséquent, cette approche est une alternative intéressante à l’expérimentation animale. Les nouvelles lignes iPSC utilisable facilement en aval expériences portant sur l’optimisation de la différenciation et l’ingénierie tissulaire.
Introduction
La technologie des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) apporte sur les thérapies de remplacement cellulaire potentielle, maladie et modélisation du développement et drogues dépistage toxicologique1,2,3. Les thérapies de remplacement est possible sur le plan conceptuel par injection de cellules, différenciées implantation tissulaire (par exemple cardiaque “patches”), in vitro, ou régénération guidée au moyen de l’ingénierie tissulaire. Liquide amniotique (AFSC) et la membrane des cellules souches (AMSC) sont une excellente source de cellules pour ces interventions soit directement4,5,6,7 ou comme une population de cellules de départ pour la reprogrammation dans la pluripotence8,9,10,11,12.
Premières approches utilisées systèmes de culture non défini ou reprogrammation méthodes nécessitant l’intégration génomique comportent des constructions9,10,11,12. Une étude plus récente a employé un milieu exempt de xeno, même si une matrice d’attachement membrane basale moins définie (BMM) a utilisé, pour générer l’iPSC de cellules épithéliales du fluides amniotique. Cependant, l’analyse de formation tératome ne figurait pas dans l’étude avec une richesse d’in vitro et les données moléculaires. Cellules épithéliales fluides amniotiques ont été trouvés pour avoir une plus grande efficacité reprogrammation environ 8 fois par rapport aux fibroblastes néonatale13. Dans une autre étude, les cellules souches mésenchymateuses du liquide amniotique se retrouvent également à être reprogrammé dans iPSC avec un beaucoup l’efficacité supérieure12.
Cellules souches pluripotentes peuvent être différenciées en représentant de tissus de tous les 3 couches de germe et donc le potentiel plus large. Les patients pédiatriques pourraient bénéficier de la récolte, la reprogrammation et l’ingénierie tissulaire de leurs cellules de tige fluides amniotiques autologues avant la naissance et cellules de membrane amniotique souches durant la période périnatale. En outre, le niveau relativement faible de la différenciation de cellules souches fœtales (inférieurs à14,de cellules souches adultes15) pourrait théoriquement aider dans la lutte contre la rétention observée de partialité épigénétique des cellules source l’iPSC16.
Nous présentons un protocole pour la reprogrammation du liquide amniotique et membranaires des cellules souches pluripotence dans défini chimiquement milieu E8 xeno-sans le recombinant vitronectine17 (VTN) à l’aide de plasmides épisomiques18. Le principal avantage des cellules du liquide et la membrane amniotique comme source de cellules pour la reprogrammation réside dans leur disponibilité avant et Pendant la période périnatale et donc cette démarche profiterait principalement recherche en génie tissulaire pédiatrique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La phase initiale de l’iPSC génération de cellules souches fœtales implique l’extraction de cellules source dans les tissus fœtaux, leur culture, expansion et introduction des plasmides reprogrammation épisomiques. Cette phase est suivie d’une période de culture d’environ 14 à 18 jours avant que les premières colonies entièrement reprogrammés peuvent être étendus. La phase finale est la maturation des clones iPSC. L’extraction initiale de cellules souches de membrane amniotique se faite au moyen d?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Fonds Medizinische Forschung à l’Université de Zurich, Forschungskredit de l’Université de Zurich, la NMS SCIEXCh sous ° 10.216 bourses et 12.176, The Swiss Society of Cardiology, The Swiss National Science Fondation au titre de la subvention [320030-122273] et [310030-143992], le 7e Programme-cadre, la soupape de vie, la Commission européenne au titre de la subvention [242008], la Fondation de Mayenfisch Olga, la Fondation EMDO, la subvention de démarrage 2012 de l’hôpital universitaire de Zurich, et le financement interne de l’Institut de Cancer de Mitchell.
Materials
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette – transfection pipette Neon device – transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip – transfection tip Neon tube – transfection tube buffer R – resuspension buffer buffer E – electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
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