Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen
Summary
Hier stellen wij een protocol voor chondrogenische differentiatie voor van bloedbloedmononucleaire cellen afgeleide door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen.
Abstract
Menselijke kraakbeen ontbreekt aan het vermogen zich te herstellen. De degeneratie van kraakbeen wordt dus niet behandeld door curatieve maar door conservatieve behandelingen. Momenteel worden inspanningen gedaan om beschadigd kraakbeen te regenereer met ex vivo geëxpandeerde chondrocyten of beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BMSC's). De beperkte levensvatbaarheid en instabiliteit van deze cellen beperken echter hun toepassing bij kraakbeenherstructurering. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) hebben wetenschappelijke aandacht ontvangen als een nieuw alternatief voor regeneratieve toepassingen. Met onbeperkte zelfvernieuwingsvermogen en multipotency, zijn hiPSCs gemarkeerd als een nieuwe vervangende celbron voor kraakbeenherstel. Het verkrijgen van een hoge hoeveelheid chondrogeenpellets van hoge kwaliteit is echter een belangrijke uitdaging voor hun klinische toepassing. In deze studie hebben we embryoïde lichaams- (EB) -uitgevoerde uitgroeicellen gebruikt voor chondrogeen differentiatie. Succesvolle chondrogenese werd bevestigd door PCR anD vlekken met alcia blauw, toluidine blauw en antilichamen tegen respectievelijk collageen typen I en II (respectievelijk COL1A1 en COL2A1). Wij bieden een gedetailleerde methode voor de differentiatie van bloedmononucleaire cel afgeleide iPSCs (CBMC-hiPSCs) in chondrogeenpellets.
Introduction
Het gebruik van hiPSC's vertegenwoordigt een nieuwe strategie voor drugscreening en mechanistische studies van diverse ziekten. Uit een regeneratief perspectief zijn hiPSCs ook een potentiële bron voor de vervanging van beschadigde weefsels die beperkte geneeskracht hebben, zoals articulair kraakbeen 1 , 2 .
De regeneratie van inheemse gewrichtskraakbeen is al enkele decennia een uitdaging geweest. Articulair kraakbeen is een zacht, wit weefsel dat het einde van de botten bekleedt, beschermt tegen wrijving. Het heeft echter beperkte regeneratieve capaciteit bij beschadiging, waardoor zelfherstel bijna onmogelijk is. Daarom is onderzoek gericht op kraakbeenregeneratie al enkele decennia doorlopend.
Vroeger werd in vitro differentiatie in de chondrogeen lijn meestal uitgevoerd met BMSC's of natieve chondrocyten die uit het kniegewricht 3 werden geïsoleerd. Wegens tO hun chondrogeenpotentieel, BMSC's en natieve chondrocyten hebben talrijke verdiensten die hun gebruik bij chondrogenese ondersteunen. Door hun beperkte expansie en instabiele fenotype worden deze cellen echter geconfronteerd met verschillende beperkingen bij de reconstructie van articulaire kraakbeenafwijkingen. Onder de in vitro- kweekomstandigheden hebben deze cellen de neiging om hun eigen karakteristieken na 3-4 passages te verliezen, wat uiteindelijk hun differentieringsvermogen beïnvloedt 4 . Ook bij nierlijke chondrocyten is extra schade aan het kniegewricht onvermijdelijk bij het verkrijgen van deze cellen.
In tegenstelling tot BMSC's of natieve chondrocyten kunnen hiPSCs onbepaald in vitro uitbreiden. Met de juiste cultuuromstandigheden hebben hiPSCs een groot potentieel als vervangende bron voor chondrogeen differentiatie. Het is echter uitdagend om de intrinsieke eigenschappen van hiPSCs 5 te wijzigen . Bovendien duurt het een aantal ingewikkelde in vitro stePs om het lot van hiPSCs naar een specifiek celtype te leiden. Ondanks deze complicaties, wordt het gebruik van hiPSCs nog steeds aanbevolen door hun hoge zelfvernieuwingsvermogen en hun capaciteit om te onderscheiden in gerichte cellen, waaronder chondrocyten 6 .
Chondrogene differentiatie wordt gewoonlijk gedaan met driedimensionale cultuursystemen, zoals de pelletkweek- of micromassa-cultuur, met behulp van MSC-achtige stamcellen. Als u hiPSC's gebruikt, verschilt het protocol voor het genereren van MSC-achtige stamcellen van de bestaande protocollen. Sommige groepen gebruiken een monolaagse cultuur van hiPSCs om het fenotype direct in MSC-achtige cellen 7 om te zetten . Echter, de meeste studies gebruiken EB's om opgroei cellen te genereren die lijken op MSCs 8 , 9 , 10 , 11 .
Verschillende soorten groeifactoren worden gebruikt om chondroge te veroorzakenNesis. Gewoonlijk worden BMP- en TGFβ-familieproteïnen, alleen of in combinatie gebruikt. Differentiatie is ook geïnduceerd met andere factoren, zoals GDF5, FGF2 en IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 is aangetoond dat chondrogenese op een dosisafhankelijke manier in MSCs 16 wordt gestimuleerd. In vergelijking met het andere isotype, TGFβ3 induceert TGFβ1 chondrogenese door de pre-kraakbeen mesenchymale cel condensatie te verhogen. TGFβ3 induceert chondrogenese door de mesenchymale cel proliferatie 17 aanzienlijk te verhogen. TGFβ3 wordt echter vaker gebruikt door onderzoekers dan TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 versterkt de expressie van genen gerelateerd aan de chondrogeen matrixcomponenten in het menselijkArticulaire chondrocyten onder in vitro condities 20 . BMP2 verhoogt de expressie van genen die kritiek zijn op kraakbeenvorming in MSC's in combinatie met TGFβ-eiwitten 21 . Het is ook aangetoond dat BMP2 het effect van TGFβ3 synergistisch verbetert via de Smad- en MAPK-pathways 22 .
In deze studie werden CBMC-hiPSC's geaggregeerd in EB's met behulp van EB-medium in een Petri-schotel met lage gehechtheid. Uitgroei cellen werden geïnduceerd door de EB's aan een gelatine gecoate schotel te bevestigen. Chondrogene differentiatie met behulp van uitgroeicellen werd uitgevoerd door pelletkweek. Behandeling met zowel BMP2 als TGFβ3 heeft de cellen succesvol gecondenseerd en geïnduceerde extracellulaire matrix (ECM) eiwit accumulatie voor chondrogeen pelletvorming. Deze studie suggereert een simpele, maar efficiënte chondrogene differentiatieprotocol met behulp van CBMC-hiPSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol heeft succesvolle hiPSC's van CBMC's gegenereerd. We herprogrammeerde CBMC's aan hiPSCs met behulp van een Sendai virale vector die Yamanaka-factoren 24 bevat . Drie gevallen werden gebruikt in differentiatie, en alle experimenten hebben succesvol chondrogeenpellets op basis van dit protocol gegenereerd. Talrijke studies hebben protocols voor de differentiatie van hiPSCs gemeld in chondrocyten 25 , 26 ,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Koreaanse Gezondheidszorg Technology R & D project, ministerie van Volksgezondheid, Welzijn & Gezin, Republiek Korea (HI16C2177).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| E8 Medium Materials | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | E8 Medium (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | E8 Medium (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | E8 Medium (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | E8 Medium (Conc.: 64 μg/mL) |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Alcian blue | Sigma Aldrich | A3157-10G | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252-25G | |
| Safranin O | Sigma Aldrich | 090m0039v | |
| Nuclear fast red | Americanmastertech | STNFR100 | |
| xylene | Duksan | 115 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| Mayer's hematoxylin solution | wako pure chemical industries | LAK7534 | |
| DAP | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| Chondrogenic Differentiation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | Chondrogenic media component (500 mL) |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM) |
| rhBMP-2 | R&D | 355-BM-050 | Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml) |
| Recombinant Hman TGF-beta3 | R&D | 243-B3-002 | Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml) |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| ITS+ Premix | BD | 354352 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma Aldrich | D2915-100MG | Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M) |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| Sodium pyruvate solution | Sigma Aldrich | S8636 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P5607-25G | Chondrogenic media component (40μg/ml) |
References
- van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future–lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
- Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
- Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
- Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
- Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16 (2017).
- Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
- Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
- Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086 (2013).
- Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
- Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
- Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
- Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184 (2016).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144 (2015).
- Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
- Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
- Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459 (2016).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498 (2008).
- Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
- Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
- Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
- Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
- Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
- Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
- Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786 (2016).
- Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
- Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal ‘stem’ cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
- Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
- Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213 (2008).
- Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
- Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
