Nanopore DNA sıralama Metagenomic toprak analizleri için
Summary
Nanopore teknoloji sıralama biomolecules için geniş uygulamalar patojenler, gıda güvenliği izleme, genom analizi, metagenomic çevre izleme ve bakteriyel karakterizasyonu kimliği de dahil olmak üzere Yaşam Bilimleri içinde vardır. antibiyotik direnci. Bu makalede, metagenomic toprak DNA sıralama nanopore sıralama teknolojisini kullanarak tür tanımlayıcısı için yordam gösterilmiştir.
Abstract
Bu makalede toprak, hazırlık ve nanopore akışı hücre kullanımı ve çözümleme bilgisayar yazılımı kullanarak tanımlanan DNA dizilerinin bir DNA Kütüphane inşaatı için adımları açıklar. Nanopore DNA sıralama bakteri suşları karakterize ve antibiyotik direnç görüşmek genetik mutasyonlar algılamak için hızlı mikrobiyal genom sıralama bakteriyel ve viral türleri, belirlemek sağlayan esnek bir tekniktir. (NS) yaşam bilimleri için sıralama nanopore avantajı, düşük karmaşıklık, düşük maliyet ve hızlı gerçek zamanlı sıralama arıtılmış genomik DNA, PCR amplicons, cDNA örnekleri veya RNA içerir. NS “tek telli DNA molekülünün bir sentetik polimer membran eklenen bir nanopore aracılığıyla rehberlik ederek sıralama DNA içeren strand sıralama” örneğidir. Membran o, bireysel üsleri ile nanopore elektrik akımı geçerken farklı derecelerde dört nükleotit bazlar tarafından bozulur öylesine genelinde uygulanan bir elektrik akımı vardır. Her nükleotit tanımlaması nanopore geçerken elektrik akımı karakteristik modülasyon tarafından farklı esaslarını tespit ederek oluşur. NS sistemi el ile oluşur, USB taşınabilir aygıt ve nanopore dizi içeren bir tek kullanımlık akışı hücre. Taşınabilir aygıt içine a standart dizüstü bilgisayar okur ve bilgisayar yazılımı kullanarak DNA dizisi kaydeden fişler.
Introduction
Bu yordamı, sıralama nanopore akışı hücre sıralama cihazın kullanımı için bir çevre DNA Kütüphane hazırlanması için gereken adımları göstermek için ve sistem yazılımı kullanarak oluşturulan DNA dizilerinin analiz gerçekleştirmek için hedeftir ve Merkezi Ulusal toprak mikrobiyal türler tanımlamak için biyoteknoloji bilgi (NCBI) Biyoinformatik araçları için. Şu anda, çoğu DNA sıralama platformlar teknik eğitim ve kaynak zavallı ortamlarda veya alan uygulamaları mümkün değildir karmaşık araçları büyük bir yatırım gerektirir. Nanopore sıralama (NS) platformu ile bir maliyet etkin, bu sorunları ortadan kaldırır Kütüphane hazırlık Protokolü ve taşınabilir bir aygıta sıra ve nükleik asitler1,3farklı türleri çeşitli analiz etmek için kullanımı kolay. Yüksek lisans öğrencileri için birkaç laboratuar dersleri NS platform dahil olması.
Nanopore teknoloji sıralama biomolecules için yaşam bilimleri, bakteriyel ve viral patojenler1,2,6, çevre biyolojik çeşitlilik tanımlamasını içeren geniş uygulamalarda göstermiştir çalışmalar, gıda güvenliği izleme, genom analizi3,5ve bakteriyel antibiyotik direnci4karakterizasyonu. NS bir elektrikli eklenen bir nanopore tek iplikçikli DNA geçtiği zaman prensibi üzerine “sıralama elektrik kesintileri algılayarak strand” bireysel nükleotit bazlar tarafından dayanır bir hızlı ve doğru sıra nükleik asitler için yöntemidir Sentetik polimer membran. DNA genom parçalanma, sonunda tamir ve 3′ genomik parçaları, adaptör ve DNA’yı, urgan tavlama dA-takip NS eklemek için hazırlanmasında ilgili adımlar DNA Kütüphane arıtma ve Kütüphane nanopore akışı hücre cihazın içine yükleme. Genom parçalanma ~ 8 kb boyutları içine 1-2 µg bir g-tüp parçalanma tüpünden genomik DNA’ın centrifuging tarafından gerçekleştirilir. Parçalanmış genomik biter sonra tamir ve piyasada bulunan bir seti kullanarak Poli dA ile izledi. Nanopore motor protein ile uyumlu olan, tek telli bağdaştırıcı dizileri eklenir DNA dizisi nanopore (şekil 1) aracılığıyla rehberlik için kullanılan DNA biter. Urgan dizileri DNA arıtma ve DNA molekülleri gözenek membran için yerelleştirme için gereklidir. Saç tokası dA kuyruklu kütüphane bir ucunu bir saç tokası bağdaştırıcısına birleştirilmesi (ligasyon) tarafından oluşturulur. Saç tokası yapılar DNA ucunda DNA nanopore (Şekil 2) geçerken anlam ve Antisens iplikçiklerinin okuma sağlar. Hazırlanan genomik Kütüphanesi sonra içine nanopore akışı hücre analizi için örnek yükleme tarafından izlenen bir manyetik alanını kullanarak streptavidin boncuk kullanarak gelen tepki saf.
Sıralı DNA kalitesi için değerlendirilir ve analiz için kabul edilebilir sıralama okuma sonra mikrop tanımlamak için çeşitli Biyoinformatik araçlar için tabi. Dizileri “bir FASTQ FAST5 biçiminden çevrilir”. FASTQ biçiminde dizileri sonra patlama analizde kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birçok sonraki nesil sıralama yöntemleri oluşturulmuştur ve her sentezi tarafından sıralaması üzerinde bağlıdır ancak farklı nükleotit tanımlamak için algılama platformlar. NS, belgili tanımlık pazar yeri yanı sıra en son zamanlarda farklı bir yöntem tamamen, hangi does değil istemek bir sıralama tepki veya nükleotid etiketli kullanır. Onlar bir elektrikli gözenek geçerken bu yöntem zaten dahil nükleotit ücret diferansiyel yararlanır. Onlar nanopore geçerken her nükleotit tanımlaması farklı üsleri tarafından elektrik akımı modülasyon tarafından oluşur. Çoğaltılmış bu sistem birçok parçaları teker teker sıralamak kullanıcı sağlar. Her iki ipliklerini DNA Sekanslama tarafından sıra doğruluğunu önemli ölçüde artar ve bir dizüstü bilgisayara yüklenebilir, sıralama yazılımı sinyalleri işleme ve analiz edilebilir sırası bilgi sağlar.
Pyrosequencing, sentez (SBS) yöntemi, bir sıralama içinde şablonu içine dahil belirli Bankası tespiti luciferase tahlil ve chemiluminescent sinyalleri8nesil bağlıdır. İyon yarı iletken sıralama, pH azalır yayımlanan hidrojen iyon bir iyon sensörü9tarafından algılanır. Hangi algılama için anonim nükleotit öğesini bir floresan molekül aydınlatan sıfır modu dalga kılavuzu (ZMW)10, tek molekül gerçek zamanlı sıralama bağlıdır. SBS oluşturulan13benzersiz sıraların kümeleri vardır öyle ki hedef DNA yükseltmek için benzersiz bir yöntem kullanır. Tagged nükleotit Floresans kaydedildiğinde eklenen nükleotit algılanması sağlanır. Bu sınırlı teknik kaynaklar gerektirir, taşınabilir, uzun sıralama okuma üretir, önceden hiçbir DNA amplifikasyon için ve düşük bir maliyetle diğer yöntemlerine göre işletilen NS diğer yandan eşsiz avantaja diğer yöntemler üzerinde sahiptir. Öğrencilerimiz olmak basit ve mükellef bir üç saat laboratuvar sınıf Kütüphane daha yeni, hızlı hazırlık Protokolü bulundu. Bazı karşılaştığımız sorunları kaldırmak zor olan akış hücre kabarcıkları, önemli bilgisayar güç (depolama bir terabayt) gerekli, alınan geçerli veri FAST5 dosyasında çıktı, ve sıralama akışı hücre daha önce sınırlı bir raf ömrü vardır bozulur. Ayrıca, NS ligasyonu sıralama Protokolü (uzun protokol) diğer dezavantajları olduğunu o, birkaç Kütüphane hazırlık adımları gerektirir moleküler biyoloji teknikleri uzmanlık gerektirir ve ne zaman bazı göre azalan sıralama sadakat oluşturur sıralama yöntemleri3. Ancak, son gelişmeler yeni hızlı Kütüphane hazırlık kiti ile sadece 10 dakika için kütüphane hazırlık gerektirir ve azalan sıralama hata oranı göstermiştir. Yeni kitaplık hazırlama yöntemi bir laboratuar sınıfı kullanmak için çok müsait.
Akış hücre QC özellikle iletişim kuralında, çeşitli kritik adımlar vardır. Bu ilk bir QC akışı hücre makbuzu beş gün içinde yapmak ve bunları 8 hafta içinde kullanarak içerir. Her ne kadar biz-si olmak kullanılmış 8 hafta olduğunu akışı hücreleri, aç/etkin gözenekleri sayısı önemli ölçüde azalır. Bu deneyler nerede en fazla kullanımı akış hücrelerinin elde bir zaman çizelgesi sığacak şekilde planlanmaktadır önemlidir. Biz temizlik protokolü kullanılan ve başarı ile akış hücreleri yeniden.
Toprak temsil mikrobiyal çeşitlilik kullanılmayan bir genetik rezervuarı metagenomics araştırıyor. Örneğin, toprak bir gram arasında 10 içeren yaklaşık7 – 109 prokaryotik hücreler14. Ayrıca, toprak organizmalar roman doğal ürünler, enzimler ve antibiyotik ana kaynağı vardır. Böylece, toprak metagenomics DNA dizi analizi eğitimin her seviyedeki öğrencilere değerli bir öğretim araç temsil eder. NS teknolojinin kolaylığı kullanım ve düşük maliyetli olun bu sistemi çok etkili öğretim aracı. Öğrenciler çevre örnekleri sıra ve sırası tamamlandıktan sonra tanımlamak ve test örnekleri mikroplar ve metagenomics serilerinde karakterize için kullanılabilir Biyoinformatik araçlarını kullanın. NS teknolojisini kullanarak, öğrenciler kadar dışarı-in şimdi laboratuar derslerinde kullanım için gelişmiş teknik uzmanlık ve diğer sıralama platformlarda yüksek reaktif, ekipman ve bakım maliyetleri nedeniyle ulaşmak vardır gerçek eller deneyimi var. Son zamanlarda, biri (J. Harrison, kişisel iletişim) çiftlik toprak, çevre izleme projesinde bu teknolojinin kullanımı bildirdi. Biz çok daha fazla uygulama için bu teknoloji eğitim alan içinde olacak bekliyoruz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje destek kısmen Johns Hopkins Üniversitesi, Provost Office tarafından yapıldı Ağ Geçidi bilim girişimi.
Materials
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R. The Metagenomics of Soil. Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).
